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结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，当前仍是全球重大公共卫生问题。根据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）统计分析，2019年全球新发结核病约1000 万例，全球因结核病死亡者约141 万例，虽然近些年结核病疫情在全球有所控制，但由于耐药结核病尤其是耐多药结核病的不断增加、泛耐药结核病甚至全耐药结核病的出现，给结核病的治疗带来巨大挑战[1]。因此，当前迫切需要开发新的、安全有效的抗结核药物。民族药材一直以来都是药物先导化合物发现的重要来源，比如青蒿素、奎宁、吗啡、紫杉醇等均分离自药用植物。白头翁具有清热解毒、凉血止痢等功效，临床研究发现，中药白头翁治疗淋巴结核有效，也有报道显示，白头翁可以抑制结核分枝杆菌的生长[2]。但由于白头翁的化学成分复杂，很难对其进行全面的研究来揭示其治疗结核病的体内机理。网络药理学作为一门新兴学科，为解决复杂的药理学问题、探索中医药疗效相关分子机制提供了新的思路和视角[3-4]。本研究拟借助网络药理学方法，全面、系统地分析白头翁的主要成分、作用靶点以及信号通路的网络关系，旨在为深入研究白头翁主要成分治疗肺结核的机制提供新的思路和线索。

1 材料与方法

1.1 白头翁药物有效成分及靶点的获取

通过中药系统药理学数据库与分析平台2.3（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php），以“白头翁”为关键词进行搜索，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，且类药性指数（drug-like index，DL）≥0.18 的两个ADME 属性值，进行白头翁活性成分初步筛选，以获得活性化合物。然后将筛选出的白头翁的活性化合物输入至Pub-Chem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nihgov/）中，查询并下载活性成分的sdf.格式文件，然后将这些sdf.格式文件分别上传至Pharm Mapper 反向药效团匹配数据库（http://59.78.98102/pharmmapper/index.php），下载得到白头翁作用靶标（按fit score>3 条件进行筛选），即为白头翁化学成分对应的靶标。最后将白头翁化学成分对应的靶标与TCMSP 数据库 “related targets” 项目中查询出各自对应的作用靶点蛋白均输入Uniprot 蛋白质数据库中（数据收集截止日期为2021年1月），筛选条件为“Reviewed”，限定物种为“Human（人）”，合并后删除重复基因，保留唯一值，最终得到白头翁活性成分的候选靶标对应的基因名。

1.2 白头翁治疗肺结核的预测靶点的筛选

通过Gene Cards 数据库（http://www.genecard.org）、OMIM 数据库（http://www.omim.org），以“Pulmonary tu berculosis”作为关键词检索肺结核的疾病相关基因，整理后去除重复的疾病基因，最终得到肺结核的疾病基因，然后将挖掘得到的肺结核相关基因与白头翁靶点基因映射筛选出共同靶点，确定白头翁治疗肺结核的作用靶点。

1.3 白头翁-有效活性成分-疾病靶点网络构建

将“1.1”项下获得的白头翁活性成分与“1.2”项中白头翁治疗肺结核作用的潜在靶点导入生物信息分析软件Cytoscape 3.6.1，构建白头翁-有效活性成分-疾病靶点网络。网络中的节点（Node）表示靶点或化合物，边（Edge）表示活性成分与疾病之间相互作用。复杂网络节点中心性可用于衡量节点在网络中影响能力大小，以判断节点的重要性。其中，度值（Degree值）为重要参数，度值越高代表该成分或靶点在网络中的位置越重要。

1.4 蛋白-蛋白相互作用网络（protein-protein interaction network，PPI）构建

将白头翁活性成分相关靶点与肺结核靶点筛选出的共同靶点上传至String（https://string-db.org/）平台构建靶PPI，限定研究物种为“homo sapiens”，最低相互作用评分设置为中度置信度（“medium confidence<0.400>”），隐藏离散靶点，其余参数保持默认设置，得到白头翁治疗肺结核的PPI 网络。再将获得的相关tsv.格式数据导入Cytoscape 3.6.1 软件进行拓扑属性分析，利用插件“network analyzer”的功能进行分析，参照度值及上述tsv.格式数据中combined score的大小构建构建“白头翁治疗肺结核作用靶点”关系网络图。

1.5 核心靶点GO 富集分析及KEGG 信号通路富集分析与可视化

利用生物学信息注释数据库6.8（the database for annotation，visualizationandintegrated discovery，DAVID，https://david.ncifcrf.gov/）对白头翁潜在治疗肺结核靶点进行GO 富集分析及KEGG 信号通路富集分析，将靶基因名修正为官方名称“official gene symbol”，基因列表与背景设置“homo sapiens（人类）”，分析结果选取P<0.05；GO、KEGG 信号通路富集分析中气泡图使用在线数据分析平台微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）绘制。

2 结果

2.1 白头翁药物有效活性成分及其靶点的获取

通过TCMSP、Pubchem、Pharm Mapper、Uniprot 数据库，共得到白头翁活性成分9 个，与活性成分相关的靶蛋白基因173 个（表1、2）。

表1 筛选所获白头翁有效活性成分

2.2 白头翁治疗肺结核预测靶点的筛选

通过GeneCards 数据库、OMIM 数据库挖掘得到肺结核相关基因776 个，将肺结核相关基因与白头翁成分基因靶点进行映射，得到共同靶基因18 个，即为白头翁治疗肺结核作用靶点，其中白头翁有效成分中只有安多芬、异鼠李素、β-谷甾醇、豆甾醇具有治疗肺结核的作用（表3、4）。

表3 白头翁潜在治疗肺结核的靶点

2.3 白头翁-有效活性成分-疾病靶点网络的构建

白头翁-有效活性成分-疾病靶点”网络拓扑图见图1（封三），结果显示，共包括23 个节点（Node），其中1 个黄色节点代表白头翁，4 个绿色节点代表白头翁的有效活性成分（9 个有效成分中有5 个有效成分未发挥治疗肺结核的作用），18 个橙色节点代表白头翁有效成分发挥治疗肺结核的作用，23 条边（Edge）代表白头翁活性成分与疾病之间相互作用。其中豆甾醇（BTW9）的节点最大（度值=11），说明其在白头翁治疗肺结核作用中发挥关键作用。

图1 白头翁-有效活性成分-疾病靶点”网络拓扑图

网络中的节点（Node）表示靶点或化合物，边（Edge）表示活性成分与疾病之间相互作用；黄色节点代表白头翁；BTW 代表白头翁；绿色节点代表白头翁的有效活性成分，其中BTW2 为白头翁有效成分安多芬；BTW7 为白头翁有效成分异鼠李素；BTW8 为白头翁有效成分β-谷甾醇；BTW9 为白头翁有效成分豆甾醇；橙色节点代表白头翁治疗肺结核作用的相关靶点；度值越高代表该成分或靶点在网络中的位置越重要

表2 白头翁有效活性成分潜在作用靶点

表4 白头翁潜在治疗肺结核的靶点

2.4 PPI 网络构建与分析

白头翁治疗肺结核的PPI 网络图见图2（封三），结果显示，白头翁有效成分靶点与肺结核靶点相映射后得到的18 个靶基因导入构建的PPI 网络中包含18 个节点（1 个靶点LTA4H 未参与PPI 网络构建）和43 条相互作用连线。PPI 网络平均度值为4.78，平均聚集系数为0.696，P=4.32×10-14。

图2 白头翁治疗肺结核的PPI 网络图

节点代表蛋白质；节点之间连线代表两个蛋白之间的相互作用；不同的颜色对应不同的相互作用类型

再将PPI 网络图导入Cytoscape 3.6.1 软件进行拓扑属性分析，结果见图3（封三），图中度值越大则节点颜色越深或越大，度值排名靠前的靶点有CASP3（度值为11）、MAPK14（度值为9）、NOS2、PPARG、RELA、JUN（度值均为8）等靶点为白头翁治疗肺结核药效作用的关键靶点，提示这些蛋白在白头翁治疗肺结核作用机制中发挥关键作用。

图3 白头翁治疗肺结核作用靶点关系网络图

度值是反映一个节点在网络中重要性的指标，度值较高的节点可视为关键节点，节点代表靶点，边代表靶点间的关系。节点的大小和颜色与度值相关，节点越大颜色由浅到深，则对应的度值越大；边的粗细与combined score 相关，边越粗则其对应值越大

2.5 白头翁潜治疗肺结核靶点基因的GO、KEGG 通路富集分析

利用DAVID 数据库对筛选出的18 个白头翁治疗肺结核关键靶点基因进行GO 分析，从分析结果中以P<0.05 条件进行筛选，共得到115 条GO 分析结果。其中细胞组成（cellular component）12 项（图4，封三），涉及胞液（cytosol）、细胞质（cytoplasm）、线粒体（mitochondrion）、死亡诱导信号复合体（death-inducing sig naling complex）、线粒体外膜（mitochondrial outer membrane）等方面；分子功能（molecular function）17项（图5，封四），涉及细胞因子活性（cytokine activity）、蛋白质同源二聚化活性（protein homodimerization activity）、蛋白质异二聚活性（protein heterodimerization activity）、转录因子（transcription factor binding）、酶结合（enzyme binding）、蛋白结合（protease binding）、受体结合（receptor binding）等方面；生物过程（biological process）86 项取前20（图6，封四），涉及细胞增殖的正向调节（positive regulation of cell proliferation）、脂多糖反应（response to lipopolysaccharide）、凋亡过程（apoptotic process）、凋亡信号通路（apoptotic signaling pathway）、药物反应（response to drug）、蛋白质水解（proteolysis）、对过氧化氢的反应（response to hydrogen peroxide）等方面。

图4 白头翁潜在治疗肺结核靶点GO-CC 富集分析气泡图

纵轴为通路名，横轴为富集因素；点的大小表示富集到的靶点数量；点的颜色代表P 值，由红到绿表示P 值由小到大

将筛选出的63 个白头翁抗菌活性关键靶点进行KEGG 富集分析并进行通路注释，得到P<0.01 的作用通路共34 条，结果见表5。其中细胞功能（cell function）相关通路9 条，分别为：破骨细胞分化、细胞凋亡、非酒精性脂肪性肝病、MAPK 信号通路、HIF-1信号通路、鞘脂类信号通路、神经营养蛋白信号通路、亨廷顿氏病、可卡因成瘾；与免疫调节（immunoregulation）相关通路4 条，分别为：NDO-样受体信号通路、肌萎缩侧索硬化症、T 细胞受体信号通路、RIG-I-样受体信号通路；与炎症（inflammation）相关通路5 条，分别为：肿瘤坏死因子信号通路、炎症性肠病、Toll 样受体信号通路、乙型肝炎、百日咳；与寄生虫（parasite）相关疾病4 条，分别为：弓形虫病、南美锥虫病（美洲锥虫病）、利什曼病、阿米巴病；肿瘤（tumor）相关通路4条，分别为：癌症通路、p53 信号通路、结肠直肠癌、小细胞肺癌、病毒致癌作用；与感染（infection）相关通路7条，分别为：肺结核、幽门螺杆菌感染中的上皮细胞信号转导、沙门氏菌感染、人类嗜T 淋巴细胞病毒I 型感染、EB 病毒感染、单纯疱疹感染、军团菌病。

表5 白头翁潜在治疗肺结核主要KEGG 通路

3 讨论

本研究以白头翁为研究对象，对其治疗肺结核的作用机制进行了初步分析。本研究经TCMSP、Pubchem、Uniprot 数据库，共筛选获得白头翁可能的活性成分9 个以及活性成分作用靶蛋白基因173 个，这些活性成分主要包括乙酸谷甾醇、丁子香萜、安多芬、β-谷甾醇、异鼠李素、豆甾醇等。现代药理学研究表明，中草药白头翁正丁醇萃取物在体外具有抗结核分枝杆菌作用，且对其具有不可恢复的杀灭作用[2]。也有研究发现，豆甾醇与β-谷甾醇具有一定的抗结核分枝杆菌活性[5-6]。本研究结果显示，白头翁发挥治疗肺结核的主要有效成分是安多芬、β-谷甾醇、异鼠李素、豆甾醇，其中豆甾醇有10 个作用靶点，异鼠李素有4 个作用靶点，β-谷甾醇有2 个作用靶点，安多芬有3 个作用靶点，这些有效成分最可能作用于CASP3、MAPK14、RELA、JUN、NOS2、PPARG 等靶点。

结核分枝杆菌是一种兼性胞内致病菌，其在机体内的主要宿主细胞是巨噬细胞。JUN 家族广泛参与结核的免疫、炎症反应，与重症继发性肺结核患者的免疫损伤相关[7]。在结核分枝杆菌感染中，MAPK 参与肺结核的免疫反应，其中MAPK14 属丝裂原活化蛋白激酶家族，参与调控细胞周期、对环境的应激适应及炎症反应等病理生理过程[8-9]。RELA 是核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）家族的一个重要的成员，其翻译后修饰可精准调控NF-κB 的转录活性，在调节炎症、肿瘤、代谢以及免疫应答等重要的生命活动，以及相关疾病的发生发展过程中起重要作用[10]。有研究发现，RELA 缺失，严重损害结核分枝杆菌H37Rv 在体内的存活[11]。caspase-3 在caspase 级联反应中是功能执行因子，是细胞凋亡发生的关键。研究表明在耐异烟肼结核病小鼠肺组织中，免疫组化染色显示，caspase-3 的表达水平与结核病的预后相关[12]。这些靶点显示皆与肺结核的病理过程有关，这反映筛选出的白头翁药物成分较为可靠，也充分说明，白头翁是通过多成分联合发挥治疗肺结核的作用。

KEGG 富集分析结果显示，与白头翁发挥治疗肺结核作用密切相关的通路有34 条，主要包括结核病、癌症通路、肿瘤坏死子信号通路等。目前，已证明癌症通路包括p53 信号通路、NF-κB 信号通路等。p53 是一种肿瘤抑制因子，可调控细胞凋亡、细胞周期阻滞，维持基因组的稳定性[13-15]。有研究发现，p53 信号通路通过负调控NF-κB 信号通路，控制细胞炎症反应，来参与肺泡Ⅱ型上皮细胞细胞的抗结核分枝杆菌免疫调控作用[16-17]；NF-κB 是重要的转录因子，具有多向性转录激活的功能，可参与炎症反应、免疫反应、细胞凋亡等多种生理病理过程[18-19]。研究发现，抑制NF-κB 可以增强巨噬细胞对结核分枝杆菌的清除作用[18，20-21]；肿瘤坏死因子，它与细胞膜上的特异性受体结合后可促进细胞的增殖和分化，引起细胞破坏、死亡以及调节机体免疫等诸多生物学效应。研究发现，在感染结核分枝杆菌的小鼠模型中，肿瘤坏死因子-α 受体缺失或者肿瘤坏死因子被中和的小鼠对结核分枝杆菌表现出极大敏感性[22]。这与本研究富集在癌症通路和肿瘤坏死子信号通路的结论是相吻合的，表明白头翁治疗肺结核是通过多层次、多通路实现的。

综上所述，本研究通过网络药理学方法，预测白头翁可能是通过其活性成分安多芬、β-谷甾醇、异鼠李素、豆甾醇，作用于CASP3、MAPK14、RELA、JUN、NOS2、PPARG 等关键靶点，经过癌症信号通路、肿瘤坏死子信号通路等发挥抗炎、调节免疫功能等药理作用，发挥治疗肺结核的作用，充分体现了白头翁有效成分发挥治疗肺结核作用机制是通过“多成分-多靶点-多通路”的作用模式。但网络药理学的研究内容通过调取相关数据库对药物的功效进行预测，仍存在一定的局限性，结论需进行后期实验研究加以验证。

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