mar 染色体指额外增加的小染色体（sSMCs），大多由异染色质构成。86%的mar 起源于端着丝粒染色体的短臂和近着丝粒区。完全由异染色质组成的sSMC可完全没有异常临床表现[1]。mar 对男性携带者的生育能力及女性生殖功能均有影响[2-3]。携带mar 染色体的患者所引发的生育障碍程度主要根据mar 大小，是否含有常染色质及其是否有表型异常等情况而定[4-5]。一般认为，表型异常、mar 含有常染色质、非含有常染色质、非家族性mar、较大mar（大于21 号）的携带者不宜生育。所以，当检测到mar 染色体时，应该采取多种检测手段对其进行遗传分析以助临床咨询[6]。本案例中的羊水标本检测到mar 染色体，缺失一条性染色体，因此采用了多重荧光定量扩增（QF-PCR）进行非整倍体和Y-STR 检测并进行遗传学分析。

本病例因唐筛18-三体1∶616 来珠海市妇幼保健院行羊水细胞染色体核型分析和染色体非整倍体QF-PCR 检测。本研究通过了医院医学伦理委员会批准，符合《赫尔辛基宣言》要求，患儿家属知情同意。羊水细胞染色体核型分析为46，X，+mar 的纯合子（图1），其父母身体健康，外周血染色体核型分析分别为46，XX 和46，XY，否认家族遗传病史。对此羊水标本进行X-STRs 检测，分析mar 染色体的来源。

 

图1 羊水染色体核型图谱

1.2.1 染色体核型分析 ①羊水细胞染色体核型制备。将无菌操作采集的羊水细胞，5000 r/min，离心8 min后，弃上清，将沉淀接种至装有5 mL 羊水细胞培养基（广州和能生物，LOT∶AF20191101）的培养瓶，37℃、5%二氧化碳培养箱培养7～8 d，待发亮细胞生长至5～6 个克隆时，换液再培养24 h，加秋水仙素0.25 μg/mL，处理45 min 后，收集培养细胞，经低渗、固定、滴片、G带染色，获取羊水细胞染色体核型。每份标本制备A、B 两线染色体。②染色体核型分析。每份羊水样本取15 个分散好的中期分裂相、外周血样本取20 个分散好的中期分裂相，在蔡司全自动分析系统下（蔡司显微镜型号Imager Z2，染色体分析系统型号Ikaros）进行3 个核型分析，异常核型及嵌合体加倍计数。按照人类细胞遗传学ISCN 2013年版国际命名体制相关标准对结果进行命名。

1.2.2 DNA 抽提 羊水细胞DNA∶取500 μL 羊水于EP管，5000 r/min 离心5 min，弃上清，沉淀中加入生理盐水1 mL，颠倒混匀后，5000 r/min 离心5 min，吸弃上清，沉淀中加入8% Chelex-100 60 μL、10 mg/L蛋白酶K 5 μL 振荡混匀后，56℃温浴2 h。100℃变性10 min，13000 r/min 离心10 min 后，取上清为DNA模板。

1.2.3 QF-PCR 扩增 取以上方法提取羊水DNA 1 μL作为模板。按Devyser 紧凑型V3 试剂盒（瑞典）说明书配置扩增体系（10 μL），在ABI9700 基因扩增仪上进行STR 扩增。循环条件∶95℃15 min；94℃30 s，58℃1 min 30 s，72℃1 min 30 s，27 个循环；72℃30 min；4℃。扩增结束后在ABI 3500DX 遗传分析仪（美国ABI 公司）进行毛细管电泳，结果用GeneMapper IDX 1.0 软件（美国ABI 公司）GeneMapper ID-X 1.0 软件（美国ABI 公司）分析。

1.2.4 AGCU Y-STR 多重荧光复合扩增 取以上方法提取羊水、外周血DNA 1 μL 作为模板。按AGCU YSTR 多重荧光复合扩增试剂盒（无锡中德美联）说明书配置扩增体系，并编制扩增程序。扩增在ABI 9700基因扩增仪上（美国ABI 公司）进行，扩增后用ABI 3500DX 遗传分析仪（美国ABI 公司）进行毛细管电泳，GeneMapper ID-X 1.0 软件（美国ABI 公司）进行基因型分析。

在13、18、21 号染色体的各个基因座上，羊水标本均为峰面积为1∶1 的双峰或单峰，在AMEL 基因座上有双峰，AMELX 与AMELY 峰面积分别为104961和181549，比值为1.73；Chr3 和ChrX 基因座峰面积分别为159477 和71227，比值为2.24；Chr7 和ChrX基因座峰面积分别为115206 和55010，比值为2.09；XY3 位点上两个峰，峰面积分别为108176 和48147，比值为2.25；X3、X9 位点上均只检测到单峰（图2，封三）。

 

图2 羊水QF-PCR 非整倍体检测性别STR 图谱

其父亲外周血在22 个Y-STR 位点上均检测到单峰。羊水标本在DYS456、DYS458、DYS393、DYS19、DYS522 五个基因座上检测到单峰，五个位点分别为15、17、15、13、13，其余17 个基因座未检测到扩增产物。在这五个基因座上，其基因型均与父亲一致（图3，封三）。

 

图3 羊水标本及羊水父亲外周血Y-STRs 图谱

A：羊水标本Y-STRs 图谱；B：羊水父亲外周血Y-STRs 图谱

大多数学者认为，sSMC 多为长臂或短臂缺失的染色体或等臂染色体[7-8]。这些染色体可为常染色体，也可为性染色体，根据相关文献报道，来源于常染色体的sSMC 中，引起胎儿畸形的风险率取决于sSMC的片段大小、断裂点及基因组成[9-11]，来源性别染色体的sSMC 多发生在性染色体疾病中[12-14]。

在本例中，羊水标本细胞核型分析有mar 染色体，QF-PCR 结果显示，在AMELX/AMELY、XY3 位点上均有双峰，说明标本可以检测到X 和Y 两条性别染色体，SRY 基因座有单峰产物，说明羊水标本为男性。Chr3 与ChrX 峰面积比为2.09，在X3、X9 位点上均只检测到单峰，说明仅有1 条X 染色体；而AMELX/AMELY 峰面积比为1.73，且XY3 上两个峰峰面积之比为2.03，说明两条性别染色体X 与Y 数目之比为1∶2。综合以上结果，羊水标本的染色体核型为46，XYY。Y-STR 分析显示∶羊水标本在DYS456、DYS458、DYS393、DYS19、DYS522 五个基因座上检测到单峰，这几个位点均分布在Y 染色体p11.2～p11.31（图4），而其余17 个分布于Y 长臂的基因座未检测到扩增产物。在这五个基因座上，其基因型均与父亲外周血标本检测一致，说明胎儿从父亲遗传了部分Y染色体。因此，此例羊水标本的Y 染色体长臂发生了断裂、丢失，Y 断臂重排而形成小额外染色体。

 

图4 Y 染色体STRs 在染色体上的分布位置

对于产前诊断标本出现mar 染色体时尤其要慎重，采取系列细胞、分子检测手段分析判断其来源及致病性[15-16]。来源于异染色质的sSMC 不能以分子诊断学手段进行检测，可行N 带、C 带进行确认。STR 位点检测各常见染色体STR 等位基因拷贝数，可快速提供相应染色体基因拷贝数信息，对于各种染色体长臂或断臂构成的小额外染色体，可快速筛查其来源。本例经STRs 位点分析，本例羊水细胞核型中的sSMC来源于Y 染色体。目前可以结合染色体微阵列分析（CMA）、原位荧光杂交分析（FISH）等各种分子诊断手段进行分析[17-19]，为遗传咨询提供有力依据。在后续的CMA 检测中，该羊水标本Yp11.31q11.1(10.5Mb)存在2 个拷贝，这2 个拷贝的Y 染色体片段连接在一起，在细胞核型分析中表现为mar 染色体，其片段正为STRs 检测所提示的位点。

综上所述，在产前诊断中，可借助STRs 分析方法快速寻找sSMC 的来源，为产前诊断进一步检测和分析提供更多遗传信息。

[1]李雯雯，方嵘，沈学萍，等.三例胎儿额外小标记染色体的遗传学分析[J].中华医学遗传学杂志，2020，37（12）：1344-1348.

[2]佟玉龙，潘虹，卫凯平，等.20486 例产前诊断样本中额外小标记染色体的核型结果分析[J].中华围产医学杂志，2019，5（22）：303-309.

[3]胡晶晶，李星，蔡婵慧，等.产前诊断额外小标记染色体的细胞遗传学回顾性分析[J].中国产前诊断杂志（电子版），2020，12（4）：55-59.

[4]张振荣，张维艳，黄建林，等.表型正常男性的纯合型额外小染色体4 例报告[J].中国优生与遗传杂志，2016，24（4）：67.

[5]Kurtas NE，Xumerle L，Leonardelli L，et al.Small supernumerary marker chromosomes∶A legacy of trisomy rescue?[J].Hum Mutat，2019，40（2）：193-200.

[6]Liehr T.Chromothripsis detectable in small supernumerary marker chromosomes（sSMC）using fluorescence in situ hybridization（FISH）[J].Methods Mol Biol，2018，1769：79-84.

[7]吴晓昀，朱燕，严芳，等.2 例胎儿15 号小额外标记染色体产前遗传学分析[J].现代妇产科进展，2019，28（5）：329-332.

[8]范佳鸣，曾艳，罗婷婷，等.一例双随体微小额外标记染色体的细胞遗传学分析[J].中国优生与遗传杂志，2018，26（11）：58-59.

[9]吴小青，安刚，何德钦，等.猫眼综合征的产前诊断及临床分析[J].中华医学遗传学杂志，2019，（5），2019，5（36）：498-501.

[10]何畑蓉，刘运强，杨元.一例罕见的嵌合型5p 部分三体综合征的临床与遗传学分析[J].中华医学遗传学杂志，2020，37（9）：1032-1035.

[11]季修庆，林颖，王玉国，等.多种分子遗传技术应用于2例小额外标记染色体胎儿的产前筛查与诊断[J].临床检验杂志，2020，38（5）：321-324.

[12]徐丹萍，戴美珍，管荷琴，等.两例嵌合Y 染色体长臂大片段缺失的产前诊断及文献回顾分析[J].浙江医学，2019，41（20）：2189-2192.

[13]张蔚卿，章卫国，杨志，等.Turner 综合征患者额外小标记染色体的来源与形态研究[J].中华医学遗传学杂志，2019，5（36）：89-91.

[14]郭玉秀，崔燕，曾碧荷，等.特纳综合征患者的染色体核型及临床表现特点[J].临床与病理杂志，2017，37（2）：221-226.

[15]吴海燕，黄柳萍，罗小芳，等.产前诊断中出现额外小标记染色体的检测模式探讨及遗传咨询[J].中国优生与遗传杂志，2019，27（12）：1432-1434.

[16]杨兰，张晓，林娟，等.额外小标记染色体患者的细胞遗传学检测[J].中华医学遗传学杂志，2019，5（36）：1047-1050.

[17]郑芳秀，史烨，王晶，等.SNP 芯片检测胎儿额外小标记染色体的研究[J].中国现代医学杂志，2019，29（9）：58-61.

[18]张剑，江雨，蔡美娇.一例罕见双额外微小标记染色体的产前诊断[J].中华医学遗传学杂志，2019，36（12）：1222-1225.

[19]章卫国，潘映秋，章鸯，等.胎儿羊水额外小标记染色体的细胞及分子遗传学分析[J].中华医学遗传学杂志，2017，34（2）：187-191.

Genetic detection and analysis of a fetal small supernumerary marker chromosome 46,X,+mar amniotic fluid sample

LONG Ruo-ting LIN Cui CHEN Shu-xia
Department of Clinical Laboratory,Zhuhai Maternal and Child Health Hospital,Guangdong Province,Zhuhai 519001,China

[Abstract]Objective Through chromosome aneuploidy analysis and analysis of a short tandem repeat on the Y-chromosome(Y-STR),a genetic analysis of an amniotic fluid specimen with chromosome 46,X,+mar was performed.Methods Quantitative fluorescence polymerase chain reaction(QF-PCR)was used to detect common chromosomal aneuploidies;the AGCU Y-STRs quantitative fluorescent multiplexing PCR amplification analysis system was used to detect 22 STR loci such as DYS391.Results The amniotic fluid specimen was detected double peaks with a peak height of 1∶1 or single peaks with a double peak height on the loci of chromosome 13,18,and 21.The peak height of STRs at the AMELY and XY3 loci was twice as high as that of the X-chromosome loci.The detection results of AGCU Y-STR quantitative fluorescent multiplexing PCR amplification analysis system showed that the peripheral blood of his father was detected a single peak at 22 Y-STR loci.Fetal amniotic fluid specimen was captured single peaks at five loci including DYS456,DYS458,DYS393,DYS19,and DYS522,and no amplified products were detected at the remaining 17 loci.At the above five loci,their genotypes were consistent with those of the father.Conclusion The ratio of sex chromosomes Y to X in amniotic fluid specimens is 2∶1.The Y-chromosome has partial deletions.The genotypes of five loci on the Y-chromosome are derived from the father.

[Key words]Chromosome cell karyotype analysis;Aneuploid;Quantitative fluorescence polymerase chain reaction;YSTR;mar;sSMC

（收稿日期：2020-12-10）