肺癌是一种非特异性疾病，很难与其他肺部疾病区分开来，采取安全、有效的早期诊断方法，可使患者平均生存期从5年以上的15%增加到85%[1-2]。目前发现，低剂量螺旋CT 对早期肺癌的检出率较低，其假阳性结果可能会导致过度诊断[3-4]。随着现代分子生物学的全面发展，许多新的肿瘤标志物对恶性肿瘤的早期诊断及筛查具有重要临床价值，而目前常规肿瘤标志物对肺癌早期诊断缺乏敏感度与特异性。代谢组学是一种新兴的组学技术，研究对象主要为小分子的代谢物（1000 kb 以下），从代谢物水平反应机体发生的一系列微小变化，适合于疾病的诊断研究[5]。代谢组学技术已被广泛的应用于肺癌的研究，已有众多学者利用多种检测技术对肺癌的诊断、治疗预测展开了相关研究，并获得优异的研究成果[6-10]。本研究通过核磁共振氢谱（1HNMR）非靶标技术对肺癌组织和正常肺组织相关的差异代谢物进行分析，再次通过利用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）靶标技术检测肺癌患者、健康人群血清中相关代谢物进行定量分析，筛选对肺癌诊断较好的代谢物组，为肺癌早期诊断提供参考。

收集2017年7月～2018年12月47例术后肺癌组织及正常肺组织标本，30例腺癌患者中男22例，女8例；年龄44～73岁，平均（58.5±11.5）岁；17例鳞癌患者中男15例，女2例；年龄46～72岁，平均（60.3±8.5）岁；基于国际抗癌联盟（UICC）第八版肺癌TNM分期，Ⅰ期18例，Ⅱ期22例，ⅢA 期7例；有吸烟史者35例。收集143例经病理确诊的肺癌患者（肺癌组）血清及99例健康体检者（正常对照组）的血清标本。肺癌组男102例，女41例；年龄39～86岁，平均（62.5±15.2）岁；腺癌69例，鳞癌52例，小细胞癌22例；TNM分期Ⅰ期25例，Ⅱ期42例，Ⅲ期52例，Ⅳ期24例；有吸烟史者105例。肺癌患者纳入标准：①血液标本为早晨9 时采集的；②无糖尿病及其他代谢疾病和长期服药史；③入选前未接受任何抗肿瘤治疗且不合并其他肿瘤，功能状态评分（PS）＜2分。标本均来自南昌大学第一附属医院胸外科及景德镇市第一人民医院呼吸内科，收集后于-80℃冷冻保存。本研究得到这两所医院医学伦理委员会批准，并取得患者的知情同意书。

冷冻保存的肺癌组织及正常组织取出后室温解冻，吸除标本表面多余的水分，精密称取0.1 g 组织置于匀浆器，3 ml 的匀浆液（80%甲醇）分3次加入匀浆器中，提取的匀浆液汇总于5 ml 的EP 管中，1000 r/min离心10 min后取1 ml 上清液于EP 管中，EP 管置于真空旋转蒸发仪中烘干。烘干物用蒸馏水460 μl 复溶，取上清液445 μl 与磷酸缓冲液50 μl、三甲基甲硅烷基丙酸钠盐溶液（重水）50 μl 混匀，12 000 r/min离心10 min，取上清液500 μl 于核磁管中，行1HNMR 检测。

将收集的所有血清标本于-80℃冰箱中取出，室温解冻。取血清样品50 μl 与30 μl 同位素标记的胆碱溶液（乙酸铵溶液）、30 μl 的80%乙腈和340 μl乙腈均匀混合，后于12 000 r/min 离心5 min，取上清200 μl 进行胆碱类物质的检测。取30 μl 血清样品与30 μl 内标溶液、30 μl 乙酸铵溶液、30 μl 的80%乙腈、和330 μl 乙腈均匀混合以沉淀蛋白，同理，超声和离心后取上清进行嘌呤类物质的检测。

1.4.1 胆碱类标准品的配置 甜菜碱、胱硫醚、二甲基甘氨酸、乙酰肉碱、乙酰胆碱、肉碱、肌酐、胆碱和S-腺苷甲硫氨酸等物质分别用水溶解配成母液。取100 μl各母液混匀，依次进行二倍稀释。取50 μl 各浓度的稀释液与30 μl 乙酸铵溶液配制的内标溶液、30 μl 80%乙腈溶液和340 μl 乙腈进行沉淀蛋白、超声和离心后进样。

1.4.2 嘌呤类标准品的配置 尿苷、黄嘌呤、鸟苷、肌苷、腺苷、鸟嘌呤、尿酸、黄嘌呤核苷、次黄嘌呤和腺嘌呤分别用2 ml 的NaOH 溶液（0.1 mol/L）溶解，甲醇稀释成一定浓度的母液。各母液吸取适量均匀混合，使各物质的浓度为20.0、10.0、5.0、2.5、1.0、0.5 μg/ml，后续浓度依次2倍稀释。取30 μl 不同浓度梯度的稀释液与30 μl 乙酸铵溶液、30 μl 内标溶液、30 μl 牛血清白蛋白溶液和330 μl 乙腈进行胆碱样标准品操作。

1.4.3 靶标代谢组学的检测方法 采用多重反应监测模式（MRM），正离子检测；电喷雾毛细管电压设定为3.0 kV，干燥气（氮气）流速为50 L/h；离子源温度为100℃，色谱柱温度为40℃，自动进样器温度为20℃；采用ACOQUITY UPLC BEH HILIC 色谱柱（2.1 mm×100 mm，7 μm；Waters，USA）；10 mmol/L 0.01%乙 酸铵（A）-乙腈（B）作为流动相，流速为0.3 ml/min。

1HNMR 的数据利用网络数据库、统计全相关谱（STCOSY）、2 维全相关谱（TCOSY）及标准品比对等方法进行代谢物鉴定，主成分分析（PCA）和偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）进行相关统计分析，变量重要性（VIP）值联合P 值得到差异代谢物。UPLC-MS/MS 的数据导入SPSS 22.0 统计学软件，采用受试者工作特征（ROC）曲线评价各代谢物的诊断性能，独立样本t 检验筛选差异代谢物，差异代谢物建立Logistic回归模型，确定诊断价值高的代谢物组合。

肺癌组织和正常肺组织的1HNMR 数据PCA 得分见图1A（封三），肺癌组织与正常肺组织两个群组之间的代谢物比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。肺癌组织与正常肺组织的PLS-DA 模型（R2X=0.424，R2Y=0.834，Q2=0.778）的得分见图1B（封三），两组区分结果几乎不存在重叠情况，二者可以有效分开。进行200次置换检验来检验所建的模型，置换检验后的R2截距为0.218，Q2 截距为-0.0622，本模型有效（图1C，封三）。

 

图1 肺癌及正常肺组织的PCA、PLS-DA 及200次置换验证分析结果

A：通过1HNMR 光谱数据生成的PCA 图；B：PLS-DA 评分图；C：PLS-DA 模型的置换测试图（200次）

对明确鉴定的且VIP 值＞1 的13种代谢物积分，脂质、乳酸和甜菜碱为肺癌组织与正常肺组织相关的差异代谢物（P＜0.05）。肺癌组织中脂质、亮氨酸、缬氨酸、3-羟基丁酸、琥珀酸、胆碱、葡萄糖、甜菜碱、甘氨酸、乳酸和甲酸的含量高于正常肺组织，差异有统计学意义（P＜0.05）；醋酸的含量低于正常肺组织，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 基于1HNMR 数据进行肺癌和正常肺组织分类的代谢物信息（ng/ml，±s）

基于1HNMR 非靶标代谢组学研究结果，发现有利于诊断的差异代谢物与胆碱及嘌呤代谢通路密切相关，两者通路上的物质均参与一碳代谢和甲基化。肺癌组血清中黄嘌呤、黄嘌呤核苷、鸟苷、次黄嘌呤和乙酰胆碱的含量高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；而血清中尿苷、腺嘌呤、腺苷、鸟嘌呤、尿酸、肌苷、胆碱、甜菜碱、肉碱、肌酐、二甲基甘氨酸、乙酰肉碱和胱硫醚含量低于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。其中黄嘌呤核苷、尿苷、鸟苷、腺嘌呤、腺苷、鸟嘌呤、尿酸、肌苷、胆碱、肉碱、肌酐、二甲基甘氨酸、乙酰肉碱、胱硫醚的组间差异有显著统计学意义（P＜0.01），甜菜碱与黄嘌呤的组间差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

表2 UPLC-MS/MS 定量检测血清代谢物水平

黄嘌呤核苷、鸟苷、尿酸、肌苷和胱硫醚对肺癌有较好的诊断价值（AUC＞0.8）（表3）。

表3 量化代谢指标的ROC 分析结果

将找出的差异代谢物进行二元向前Wald 的Logistic回归分析，胱硫醚、鸟苷、尿酸和腺嘌呤联合的标志物组合会提高诊断性能，建立的模型方程为Y=10.774+3.891×X1+0.527×X2-0.001×X3-0.028×X4（X1：鸟苷的浓度；X2：腺嘌呤的浓度；X3：尿酸的浓度；X4：胱硫醚的浓度），AUC 为0.993，分类准确度为93.0%，敏感度和特异性分别是92.4%和100.0%，ROC曲线见图2。

 

图2 组合变量进行肺癌诊断的ROC曲线

早期筛查已成为肺癌防治的关键，目前临床应用的癌胚抗原、神经元特异性烯醇化酶、鳞状细胞抗原及细胞角蛋白19 片断抗原对肺癌早期诊断价值有限，探索诊断肺癌特异性强、敏感性高的生物标志物成为临床研究的热点。

本研究利用1HNMR 非靶标代谢组学技术结果显示：肺癌组织中脂质、亮氨酸、缬氨酸、3-羟基丁酸、琥珀酸、胆碱、葡萄糖、甜菜碱、甘氨酸、乳酸和甲酸的含量高于正常肺组织，差异有统计学意义（P＜0.05）；醋酸的含量低于正常肺组织，差异有统计学意义（P＜0.05）；与前人研究结果一致[11]。肺癌组织中乳酸、3-羟基丁酸水平的上升，可能与癌症本身能量代谢密切相关，肿瘤组织出现有氧呼吸减慢，无氧酵解增强有关[12-13]。

由于血液是容易获取的生物标本，本研究对肺癌患者血液中代谢物进行研究，考察肺癌组织代谢产物与血液中代谢物变化相关性，对肺癌的诊断具有重要意义。肿瘤组织作为肺癌直接病变部位，其代谢产物能更好展现癌症的状态。首先以肺癌组织为研究标本，利用非靶标代谢组学方法对其代谢物测定，然后再用靶标代谢组学方法对血清中代谢物进行研究。结果显示：肺癌组血清中黄嘌呤、黄嘌呤核苷、鸟苷、次黄嘌呤和乙酰胆碱的含量高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；而血清中尿苷、腺嘌呤、腺苷、鸟嘌呤、尿酸、肌苷、胆碱、甜菜碱、肉碱、肌酐、二甲基甘氨酸、乙酰肉碱和胱硫醚含量低于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。肺癌患者血清乙酰胆碱含量升高，可能与胆碱乙酰化酶的活性增加或胆碱酯酶的活性下降有关[14]。肺癌患者较正常对照组血清次黄嘌呤、鸟苷含量明显升高，然而鸟嘌呤、肌苷含量显著下降，或许是因为嘌呤核苷磷酸化酶的活性增加，也可能是因为鸟嘌呤脱氨酶及次黄嘌呤核苷酸脱氢酶活性增加，促进其合成[15-16]。

另外发现，肺癌患者的血清胱硫醚含量降低，这可能与分解胱硫醚的胱硫醚-β-裂解酶活性升高或胱硫醚-β-合酶的活性降低密切相关。然而肺癌患者血清尿酸的含量下降可能是由于排泄出现障碍、重吸收的尿酸减少，一定水平的尿酸可以抗氧化、清除自由基、增强免疫、降低患癌的风险[17-19]。血清中的甜菜碱与胆碱含量降低可能与合成减少明显有关[20]。

通过非靶标UPLC-MS/MS 定量结果显示的两组差异有统计学意义的指标作为因变量，经二元Logistic回归分析，联合测定血清代谢物胱硫醚、鸟苷、尿酸和腺嘌呤为最佳生物标志物组合，AUC 为0.993，敏感度和特异度均大于85%。为肺癌的早期诊断提供参考。

然而，本研究也存在以下缺陷：①临床研究样本量偏小；②代谢组学结果没有与肺癌患者驱动基因及免疫状态进行相关研究。鉴于此，本研究后期加大肺癌临床样品量，增加代谢物筛选量，以找到更好的代谢物，为肺癌早期诊断提供新的方法。并将继续探讨肺癌代谢组学与基因组学-转录组学-蛋白质组学的相关性，为肺癌精准治疗提供新的方向。

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Application of non-target and target metabolomics techniques in the screening of serum markers for the diagnosis of lung cancer

ZHENG Wei-liang1 YU Jiang-qing1▲ DU Fen2 XIE Bao-gang2 HE Xiang-yuan3
1.Department of Respiratory Medicine,Jingdezheng NO.1 People′s Hospital,Jiangxi Province,Jingdezheng 333000,China; 2.School of Pharmaceutical Science,Nanchang University,Jiangxi Province,Nanchang 330006,China; 3.Department of Thoracic Surgery,the First Affiliated Hospital of Nanchang University,Jiangxi Province,Nanchang 330006,China

[Abstract]Objective To explore the application value of non-target and target metabolomics technology in the screening of serum markers in lung cancer diagnosis.Methods Based on 1HNMR metabolomics,47 cases of post-operative lung cancer tissues and their corresponding normal lung tissue samples from the First Affiliated Hospital of Nanchang University and Jingdezheng NO.1 People′s Hospital were determined to identify their metabolites and obtain the differential metabolites related to the diagnosis of lung cancer from July 2017 to December 2018.The quantitative analysis of related metabolites in serum of 143 lung cancer patients and 99 healthy control group was carried out by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS).The excellent metabolite combinations for lung cancer diagnosis were screened based on Logistic regression analysis and receiver operating characteristic curve.Results 1HNMR metabolomics analysis showed that lipids,lactic acid and betaine were differentially metabolites related to lung cancer tissues and normal tissues,suggesting that methylation-related metabolites might be related to the diagnosis of lung cancer.The results of UPLC-MS/MS quantitative analysis showed that the serum samples of lung cancer andhealthy group had significant statistical differences in cystathionine,carnitine,acetyl carnitine,xanthylinucleic acid,guanosine,guanine,inosine,creatinine,uridine,choline,adenine,dimethyl-glycine,adenosine and uric acid (P＜0.05).The combined area under the curve of cystathionine,guanosine,uric acid and adenine was 0.993,with high sensitivity and specificity (＞85%).Conclusion The combination of non-target and target metabolomics techniques to determine serum adenine,guanosine,uric acid and cystathionine can be used as a potential serum marker for the diagnosis of lung cancer and is worthy of further clinical confirmation and research.

[Key words]Diagnosis of lung cancer;Markers;Metabonomics; HNMR; UPLC-MS/MS

[中图分类号] R734.2

[文献标识码] A

[文章编号] 1674-4721（2020）11（a）-0004-05

[基金项目]江西省卫健委科技计划项目（20197249）

[作者简介]郑巍亮（1986-），男，本科，主治医师，研究方向：肺癌早期诊治

（收稿日期：2020-04-07）