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宫颈癌在全世界妇女恶性肿瘤中位居第二，发病率呈逐年上升趋势，年新发病人数约53万，主要发生在发展中国家，西方发达国家宫颈癌发病率的下降得益于宫颈癌筛查的普及[1]。我国宫颈癌约以7.3%速率增长，由于筛查普及不足，多数患者确诊时已属于晚期，治疗效果差，严重威胁生命健康[2]。早期发现及诊断是宫颈癌治疗的关键，宫颈癌前病变及发生发展与人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）持续感染密切相关[3]。炎症因子核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）、环氧合酶（cyclooxygenase，COX-2）在慢性炎症和致癌通路中发挥重要作用 [4]。研究指出下降NF-κB 的DNA 结合活性，减少COX-2 蛋白表达可预防肿瘤的出现[5]。NF-κB、COX-2 在宫颈癌的作用尚不明确，本研究旨在探讨NF-κB/COX-2信号通路在宫颈癌中的作用及潜在机制，以期为宫颈癌的诊断和治疗提供新的靶标，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂

人宫颈癌Hela细胞系购自中科院上海细胞库；慢病毒载体pLenR-GPH、病毒包装辅助质粒pRsv-REV，pMDlg-pRRE，pMD2G，Transfer Vector、293T细胞、大肠埃希菌菌株DH5α、dsDNA oligo 购自Beyotime公司；限制性内切酶购自Takara公司；胎牛血清（FBS）（批号：10270-106）、DMEM 培养基（批号：C11995）购自美国Gbico公司；兔抗COX-2（批号：ab120295）购自美国Abcam公司；p65（批号：PA141573）、p-p65（批号：AF2006）购自Affinity公司；羊抗鼠/兔二抗（批号：F2761）购自美国Gibco公司；大提质粒试剂盒购自美国Qiagen公司；LipofectaminTM 2000、胰蛋白酶、Trizol、SYBR 购自美国Invitrogen公司；Annexin V-APC凋亡试剂盒购自美国eBioscience 美国公司；流式细胞仪（Guava easyCyte HT）购自美国密理博公司。

1.2 实验分组

未转染的Hela细胞作为对照（Hela组），转染RNAi阴性对照Scramble 的为NC组，此外3组shRNA COX-2稳定转染的Hela细胞分别为Sh1、Sh2及Sh3组，选择其中敲减效率最高的为KD组。

1.3 实验方法

1.3.1 RNAi 慢病毒载体构建及慢病毒病毒转染Hela细胞根据Genebank 中COX-2 序列（PTGS-2，NM_000963）为模板选择3 段靶序列：RNAi（1）5′-GCTGAATTTAACACCCTCTAT-3′、RNAi（2）5′-CCATTCT CCTTGAAAGGACTT-3′、RNAi（2）5′-CCGGAATTTTT GACAAGAA-3′。同时设计RNAi 阴性对照Scramble序列：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。再根据以上3 段序列设计寡核苷酸序列，该序列中插入Age I、EcoR I 酶切位点，每对寡核苷酸序列退火后可形成短发夹结构，其中发夹环为19个碱基组成的小片段DNA 双链（表1）。聚合酶链式反应（PCR）鉴定阳性重组子后，送上海领科生物科技有限公司进行测序验证。利用慢病毒载体包装系统，然后共转染293T细胞，转染后8 h 然后继续培养48 h后，收集细胞上清液。取对数生长期的Hela细胞，以5×104cell/孔接种于6孔板中，置入37℃5%CO2 培养箱培养。细胞融合度达到约30%后加入适宜量的病毒，12 h后观察细胞状态：如果没有明显的细胞毒性作用，继续培养24 h后更换培养基；如果有明显的细胞毒性作用，立即更换培养基，感染3 d后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。

1.3.2 Western Blot检测蛋白表达收集慢病毒转染96 h 的Hela细胞，提取蛋白并测定浓度。恒流300 mA 150 min条件下湿转法转膜。室温下封闭1 h，加入TBST 稀释的COX-2（Abcam，1∶1000），p65（Abcam，1∶1000），p-p65（Abcam，1∶1000），4℃震荡孵育过夜、TBST 洗涤后，加入二抗室温孵育2 h。充分洗涤后通过ECL 化学发光进行曝光。采用Image J 软件计算灰度值。

表1 寡核苷酸序列表

1.3.3 CCK-8 实验检测细胞增殖能力取对数生长期的各组细胞制备成细胞悬液，计数细胞后种入96孔板细胞密度（约2000个/孔），每组3～5个负孔，共5个96孔板，连续检测5 d，置入37℃5%CO2培养箱培养。从铺板后第2天开始，培养终止前24 h，每孔加入10 μl 的CCK-8，无需换液，注意尽量避免吹入气泡，2～4 h后，振荡器振荡5～10 min，立即酶标仪450 nm检测OD值，如果空中出现影响测量结果的气泡，用烧热的注射器针头戳破，对数据进行统计绘图。

1.3.4 Transwell 实验检测细胞迁移能力 Transwell小室上加入100 μl 细胞悬液，下室加入600 μl 30%FBS 培养基。37℃培养箱培养，Giemsa 染色液染色转移细胞，空气晾干，显微镜拍照。

1.3.5 流式细胞仪检测细胞凋亡收集悬浮细胞离心（2000 r/min离心5 min），用PBS洗涤细胞2次（2000 r/min离心5 min）收集1.5×105 细胞，加入500 μl的Binding Buffer 悬浮细胞；加入5 μl Annexin V-FITC混匀后，加入5 μl Propidium Iodide，混匀；室温、避光、反应5～15 min；在1 h 内，进行流式细胞仪的观察和检测。

1.4 统计学方法

采用IBM SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（

）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 构建shRNA-COX-2稳定转染的Hela细胞

构建三组shRNA-COX-2稳定转染的Hela细胞，Western Blot检测各组COX-2的表达，结果显示，Sh1、Sh2及Sh3组的COX-2表达均低于Hela组及NC组（P<0.05）；NC组与Hela组的COX-2比较，差异无统计学意义（t=2.721，P>0.05）。根据敲减结果选择Sh3组作为后续实验细胞株（图1）。

图1 构建shRNA-COX-2稳定转染的Hela细胞

2.2 敲减COX-2表达对Hela细胞增殖、克隆能力的影响

通过CCK-8法检测敲减COX-2表达对Hela细胞增殖能力的影响，结果显示，生长72 h时KD组的增殖能力低于NC组，差异有统计学差异（P<0.05）；生长96 h时差异更为明显（P<0.05）（图2A）；敲减COX-2表达后，KD组克隆细胞克隆形成能力低于NC组，差异有统计学差异（t=4.871，P<0.05）（图2B）。

图2 敲减COX-2表达对Hela细胞增殖、克隆能力的影响

2.3 敲减COX-2表达对Hela细胞凋亡与迁移能力的影响

通过Transwell 法检测Hela细胞迁移能力，结果显示，KD组的细胞迁移能力明显低于NC组，差异有统计学意义（P<0.001）；NC组与Hela组的细胞迁移能力比较，差异无统计学意义（P>0.05）（图3A）。通过Annexin V-PI 法检细胞凋亡情况，结果显示，敲减COX-2表达后，KD组与NC组的细胞凋亡率比较，差异无统计学意义（t=0.997，P>0.05）（图3B）。

图3 敲减COX-2表达对Hela细胞凋亡与迁移能力的影响

图4 敲减COX-2表达对Hela细胞NF-κB通路的影响

2.4 敲减COX-2表达对Hela细胞NF-κB通路的影响

Western Blot检测NF-κB通路相关蛋白p65及p-p65的表达，当敲减Hela细胞COX-2表达后，KD组的COX-2、p65及p-p65表达均低于NC组，差异有统计学意义（P<0.001）（图4）。

3 讨论

HPV 持续感染是宫颈癌病变的重要原因，HPV DNA 整合发生于宫颈病变早期，病毒致癌基因E6和E7活化，E2抑制内源性E6基因表达并诱导宫颈细胞肿瘤坏死因子-α （TNF-α）介导的NK-κB激活[6]。NF-κB通路不仅是炎症反应的关键信号，其异常活化可导致哮喘、肠炎及多种肿瘤疾病的发生。此外，NF-κB通路在宿主的先天性和适应性免疫反应中发挥重要作用[7]。早期病变时，NF-κB 的激活抑制HPV持续感染状态。在发展成高度上皮内瘤变和宫颈癌的进程中，发挥协同作用促进病变[8-9]。实体瘤中NF-κB自身基因突变少见，但上游信号分子（如RAS、EGFR、PGF、HER2）的突变与活化NF-κB 信号传导有关[10]。NF-κB可以通过端粒酶调控增殖调节基因，如cyclin D1和c-myc，参与细胞恶性转移、血管内皮生长因子（VEGF）依赖性的血管生成和细胞永生基因的转录激活[11-12]。NF-κB 激活还可以诱导激活胞嘧啶脱氨酶和APOBEC 蛋白的表达，进而间接或直接参与宫颈癌的发生[13]。

COX-2作为前列腺素E2 合成通路上的关键酶，在细胞凋亡、血管生成、免疫抑制及细胞迁移等过程中发挥重要作用，与宫颈癌发生进展密切相关[14]。COX-2的活性受到NF-κB 的调节，在非小细胞癌中，NF-κB 激活上调COX-2的表达[15]。前列腺素E2 的抑制剂hyaluronan抑制白介素-1（IL-1）诱导的NF-κB活性，前列腺素E2表达和NF-κB 活性相关[16]。NF-κB调控多种涉及转移侵袭的基因表达，包括基质金属蛋白酶9（MMP9）和VEGF，MMP9 参与基质胶原降解进而影响了癌细胞转移和侵袭，激活NF-κB 信号可以诱导MMP9表达促进细胞侵袭[17-18]。最近研究显示姜黄素可以通过下降NF-κB 的DNA 结合活性，减少COX-2 蛋白来调控癌细胞的增殖与凋亡[19-20]。

本研究通过构建稳定表达shRNA-COX-2的Hela细胞，敲减COX-2表达后观察对Hela细胞生物学功能的影响，结果显示，敲减COX-2后显著抑制宫颈癌Hela细胞的增殖、克隆形成及迁移能力，但并未明显影响Hela细胞凋亡能力，提示COX-2是Hela细胞恶性表型的关键基因。进一步探究COX-2的调控作用，抑制p65及p-p65表达，介导NF-κB 信号通路发挥作用。但NF-κB/COX-2信号通路如何在宫颈癌Hela细胞中发挥关键作用，具体上下游调控机制有待于更深入的研究。

综上所述，下调COX-2可能通过NF-κB通路抑制宫颈癌Hela细胞的增殖、克隆能力，并降低细胞的侵袭迁移作用，有利于深入了解其作用机制，为宫颈癌的精准个体化治疗提供方向。

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