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叶酸作为人体所必需的B族维生素，参与人体众多重要物质的合成和代谢。叶酸的缺乏可以导致基因组DNA链的断裂、染色体的不稳定及尿嘧啶的错配等，进而破坏了DNA的合成和修复，影响核酸、组蛋白甲基化修饰的改变[1]。叶酸代谢酶亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）和甲硫氨酸合成酶还原酶（MTRR）的基因多态性是影响唇裂、唐氏综合征等疾病发病的重要因素[2-3]。叶酸代谢基因与某些临床不良事件存在一定的相关性，如不良妊娠事件（复发性流产、低体重患儿、早产儿和出生缺陷等）、癌症（胃癌、大肠癌和宫颈癌等）、心血管疾病和精神疾病等。

研究表明，MTHFR C677T和MTRR A66G位点的突变是导致叶酸水平下降，从而导致婴儿发生神经管畸形和其他出生缺陷的高危因素[4-5]。此外，MTHFRA1298C虽未被证实和出生缺陷的发生存在必要关系，但其基因多态性与血浆同型半胱氨酸（Hcy）水平具有显著相关性[6]，而Hcy水平偏高是影响神经管畸形、先天性心脏病、唇腭裂等出生缺陷的危险因素之一[7]。

本研究的目的在于探讨湖北省恩施利川市汉族妇女人群 MTHFR C677T、MTHFR A1298C、MTRR A66G位点多态性分布情况，获得本地区的群体遗传特征，同时将本文数据与其他地区少数民族人口进行对比，为不同地域的人群预防出生缺陷制定具有针对性的干预措施提供有效的科学依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究经湖北省恩施州利川市人民医院医学伦理委员会审核批准，排除非本地区户籍及DNA抽提不合要求的样本，选取2015年1月～2017年12月在湖北省利川市人民医院建卡及做孕期保健的553例土家族和681例汉族女性作为研究对象。在受检者知晓本研究情况并签署知情同意书后，通过提取口腔黏膜细胞中的DNA，进行基因检测，评估其叶酸利用能力。

1.2 方法

1.2.1 仪器及试剂

MTHFR基因C677T、A1298C位点和MTRR基因A66G位点的SNP分型采用Taqman-MGB技术测定。

1.2.1 .1仪器低温离心机Beckman J-6BABI、7900型荧光定量PCR仪，相关仪器均使用美国Applied Biosystems（AB）公司产品。

1.2.1 .2试剂 Buffer A、Buffer B、饱和酚、氯化钠及异

丙醇等，相关试剂均使用美国AB公司产品。

1.2.2 样本DNA的采集

由经过专业培训的人员进行样本采集工作。使用专用的口腔黏膜上皮细胞采集器进行操作，提取受检者的口腔黏膜上皮细胞，具体方法为：在口腔内一侧上下刮拭40次以上，力量以略微鼓起为宜，然后利用柱式抽提试剂盒抽提样本的DNA。

1.2.3 基因检测

MTHFR基因 C677T、A1298C位点和 MTRR A66G基因位点的SNP分型采用Taqman-MGB技术测定，相关仪器、试剂均使用美国AB公司产品。

1.2.4 荧光定量PCR检测

对3个位点同时进行荧光定量PCR反应，反应所用探针信息如表1所示。

每个反应体系的总体积为10 μl，包含浓度为20 ng/μl的 DNA 模板 1 μl，2×Taqman Universal Master Mix 5 μl，20×Taqman-MGB 探针 0.5 μl，去离子水3.5 μl。

反应条件：95℃预热10 min，随后在92℃下15 s，60℃1 min的条件下进行20个循环扩增，再接着进行 30 个循环的扩增（80℃ 15 s，60℃ 90 s）。反应结束后在ABI7900型荧光定量PCR仪上读取样品孔中的终点荧光，利用分析软件确定各个样品的基因分型结果。

表1 Taqman-MGB探针所在位置

1.3 观察指标

样本MTHFR基因C677T、A1298C位点和MTRR基因A66G位点基因多态性。

1.4 统计学方法

采用HaploView 4.2软件进行SNPs的Hardy-Weinberg平衡及连锁不平衡水平（LD）分析。采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，计数资料采用率表示，组间比较采用 χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡检验结果

本研究Hardy-Weinberg平衡校验目的是验证样本的可靠性。结果表明，收集到的湖北省恩施利川市土家族和汉族人群的MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G基因多态性分布情况符合遗传平衡（P>0.05），数据来自同一孟德尔群体，样本具有区域代表性。

2.2 各民族育龄妇女MTHFR C677T、MTHFR A1298C和MTRR A66G位点基因型构成的比较

本研究采用思南苗族[8]、延边朝鲜族[9]、南宁壮族[10]、乌苏哈萨克族[11]、银川回族[12]、新疆维吾尔族[13]数据进行比较，研究结果提示，湖北省恩施州利川土家族和汉族妇女之间各位点的基因型构成比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。利川土家族妇女MTHFR C677T位点的基因型构成与延边朝鲜、南宁壮族、乌苏哈萨克族、银川回族妇女比较，差异有统计学意义（P<0.05）；利川土家族妇女MTHFR A1298C位点的基因型构成与南宁壮族、乌苏哈萨克族妇女比较，差异有统计学意义（P<0.05）；利川土家族妇女MTRR A66G位点的基因型构成与乌苏哈萨克族、新疆维吾尔族妇女比较，差异有统计学意义（P<0.05）（表2）。

2.3 各民族育龄妇女MTHFR C677T、MTHFR A1298C和MTRR A66G位点等位基因频率的比较

湖北省恩施州利川土家族和汉族妇女之间各位点的等位基因频率比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。利川土家族妇女MTHFR C677T位点的等位基因分布与延边朝鲜、南宁壮族、乌苏哈萨克族、银川回族妇女比较，差异有统计学意义（P<0.05）；利川土家族妇女MTHFR A1298C位点的等位基因频率与南宁壮族、乌苏哈萨克族妇女比较，差异有统计学意义（P<0.05）；利川土家族妇女MTRR A66G位点的等位基因频率与乌苏哈萨克族、银川回族、新疆维吾尔族妇女比较，差异有统计学意义（P<0.05）（表3）。

2.4 MTHFR C677T和MTHFR A1298C位点组合情况

湖北省恩施州利川市土家族妇女MTHFR C677T和A1298C两位点出现了6种组合情况，最常见的三种组合依次为：CT/AA 35.5%、CC/AC 19.3%、CC/AA 17.9%（表4）。单倍型分析表明，存在三种组合：CA（65.9%），TC（20.8%），TA（13.3%）。 MTHFR C677T 和A1298C两位点存在较大程度的连锁不平衡现象（D′=1.0，r2=0.508）。汉族妇女MTHFR C677T 和 A1298C 两位点出现了6种组合情况，最常见的三种组合依次为：CT/AA 32.5%、CT/AC 24.9%、CC/AC 18.4%（表4）。单倍型分析表明，存在三种组合：CA （63.1%），TC（19.8%），TA（17.0%）。MTHFR C677T 和 A1298C 两位点存在连锁不平衡现象（D′=1.0，r2=0.424）。

表2 各民族育龄妇女MTHFR C677T、MTHFR A1298C和MTRR A66G位点基因型构成的比较[n（%）]

表3 各民族育龄妇女MTHFR C677T、MTHFR A1298C和MTRR A66G位点等位基因频率的比较[n（%）]

表4 MTHFR C677T和MTHFR A1298C位点组合情况[n（%）]

3 讨论

叶酸是一种重要的人体必需营养素，是水溶性B族维生素家族中的一员。1941年，美国科学家米切尔在菠菜中发现叶酸[14]。叶酸分为天然叶酸和合成叶酸两种。天然叶酸广泛存在于动植物食品中，在酵母、肝脏以及蔬菜中含量尤为丰富。由于食物中的叶酸易被光照、加热等环境因素影响，因此日常膳食中的叶酸在人体内生物利用度较低。与之相比，合成叶酸化学性质稳定，故广泛应用于围生期妇女等需要长期补充叶酸的人群[15]。

自2000年中国营养学会首次将叶酸列入膳食营养素参考摄入量以来，我国居民的叶酸摄入量得到明显改善。一项中国居民营养状况调查研究中显示[16]，中国3～12岁儿童叶酸水平为7.62 mg/L，总缺乏率为7.52%。健康成年人的叶酸水平检测数据结果提示，叶酸缺乏率随年龄增长呈“两边高，中间低”的趋势，这可能与儿童与老年人叶酸吸收代谢功能差有关。研究结果还表明[17]，男性血清叶酸缺乏率明显高于女性，这可能与男性吸烟和饮酒史等因素相关。根据我国35～64岁人群血液叶酸状况较大样本调查结果显示，南方夏秋季节红细胞叶酸与冬春季节相比显著下降，北方则显著升高[18]。由此可见，叶酸补充剂量的制定应该综合考虑到人群、地区等多方面差异。

本研究结果提示，湖北恩施利川市土家族和汉族妇女的叶酸代谢遗传多态性分布和其他民族汉族妇女存在差异。湖北省恩施州利川市利川土家族和汉族妇女之间各基因分布比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。湖北省恩施州利川市土家族MTHFR 677TT纯合突变基因型频率为10.8%，低于利川汉族（13.7%）、思南苗族（12.9%）、延边朝鲜（18.8%）、新疆维吾尔族（10.9%），高于南宁壮族（5.1%）、乌苏哈萨克族（5.0%）、银川回族（6.5%），与延边朝鲜族、南宁壮族、乌苏哈萨克族、银川回族比较，差异有统计学意义（P<0.05）；MTHFR A1298C位点基因型分布与南宁壮族、乌苏哈萨克族妇女比较，差异有统计学意义（P<0.05）；而MTRR A66G位点的基因型分布与乌苏哈萨克族、新疆维吾尔族妇女比较，差异有统计学意义（P<0.05）。根据以上数据对比，MTHFR、MTRR的基因多态性分布受到民族影响，具有一定的民族特异性。

综上所述，本文通过开展对湖北省恩施利川市土家族和汉族MTHFR和MTRR基因多态性和地区分布特征的研究，了解湖北省恩施利川市不同民族和不同地区的叶酸代谢相关基因的多态性分布。为我国制定个性化的叶酸补充方案和各项妇幼保健政策的制定提供有力的理论支持。

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