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马齿苋（Portulaca oleracea L.），素有“天然抗生素”之称[1]。历代医家和民间医生，均知晓马齿苋清热解毒消炎的功能。《本草纲目》言其“散血消肿，利肠滑胎，解毒通淋”；《新修本草》曰其“主诸肿瘘疣目，诸淋，金疮血流……”。现代研究发现，马齿苋具有明显的抗炎作用[2]。马齿苋水煎液降低异位性皮炎患者血清总IgE，减缓皮肤炎症[3]，水醇提取物可以通过抑制肿瘤坏死因子（TNF-α）和抗炎活性来改善大鼠海马中脂多糖诱发的被动回避学习记忆和TNF-α损伤[4]。马齿苋提取液可以减少湿疹大鼠皮肤的炎症反应，对湿疹皮肤具有明显的疗效[5-6]。马齿苋水提物对溃疡性结肠炎保护作用[7]。金天云等[8]发现马齿苋化学成分具有抗炎活性，对脂多糖诱导RAW264.7巨噬细胞中一氧化氮（NO）的产生具有强的抑制作用。

目前，马齿苋抗炎活性研究只限于水和乙醇[9-11]，Liu等[12]研究发现80%乙醇提取物能够显著减少TNF-α活化的小鼠巨噬细胞RAW264.7内促炎因子白细胞介素 6（IL-6）、TNF-α 的产生。Yue 等[13]研究发现 80%乙醇提取物上调了鼠肺NF-κB水平，减少ROS的产生并显著降低了炎症因子IL-1β和 TNF-α水平。Meng等[14]从水提取物的50%乙醇部分中分离得到一种具有抗炎活性的生物碱oleracone。但未见马齿苋不同极性部位（石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、乙醇和水）提取物抗炎效果比较的研究报道。因此，本研究将考察各种提取物对RAW264.7巨噬细胞增殖作用和脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞炎症模型分泌NO的影响，以期为后续抗炎物质基础研究、抗炎药物和其他抗炎产品的开发提供理论依据，现报道如下。

1 材料

1.1 仪器与设备

XDS-1A倒置显微镜（上海精密仪器仪表有限公司）；xMark微孔板吸光度分光光度计（美国BIO-RAD公司）；VS-840K（U）超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；Steri-Cycle CO2培养箱（美国Thermo公司）；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；DW-86L288超低温冰箱（青岛海尔股份有限公司）；HYRO-4.0超纯水仪（西安优普仪器设备有限公司）；MS105 1/10万电子分析天平（梅特勒-托利多常州公司）；TD20002A电子天平（浙江力辰仪器科技有限公司）；6202型高速粉碎机（北京开创同和科技发展有限公司）；L80-2型离心机（上海跃进医疗器械有限公司）；KQ-250E超声波清洗仪（宁波江南仪器厂）；RE-52B旋转蒸发仪（上海博通化学科技有限公司）；SHZ-D（III）循环水式真空泵（郑州科丰仪器设备有限公司）；MH-2型微量振荡器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；Millex-GP针头滤器（美国Millipore公司）；Grade2快速定性滤纸（英国 Whatman公司）。

1.2 药材与试剂

小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞株受赠于浙江中医药大学；马齿苋药材（康美药业股份有限公司，产地：广东，批号：161011731），按照《中国药典》2015 年版一部鉴定为马齿苋科植物马齿苋Portulaca oleracea L.；LPS（美国 sigma公司）；DMEM高糖培养基（液态，新西兰 Gibco公司）；新生胎牛血清（澳大利亚Cellmax公司）；DMSO（美国 sigma公司）；青链霉素双抗液（杭州诺扬生物技术有限公司）；Griess试剂（上海碧云天生物技术有限公司）；无菌PBS缓冲液（吉诺生物医药技术有限公司）；乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚（30 ～60℃）（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）。

2 方法

2.1 样品的制备

2.1.1 不同极性部位提取物的制备取马齿苋药材粉碎，制成马齿苋粉，过20目筛，储于干燥器中备用。将马齿苋粉分别加入到石油醚（30 ～60℃）、乙醚、乙酸乙酯、乙醇、水中，料液比 1∶30（m∶V），40℃，60%功率超声提取30 min，布氏漏斗抽滤2次，50℃左右减压浓缩至膏状，4℃冰箱保存备用。

2.1.2 含药培养液的制备将“2.1.1项”下制得的石油醚、乙醚、乙酸乙酯、乙醇提取物加入DMSO溶液，40℃超声溶解，配置成提取物质量浓度分别为0.4、0.4、0.4、1.6 g/ml的母液。水提取物加入超纯水，40℃超声溶解，配置成质量浓度为0.4 g/ml母液。在超净工作台下，精密吸取50 μl石油醚、乙醚、乙酸乙酯、乙醇和水提取物母液，先加入1200 μl DMEM高糖培养基稀释25倍，混匀后，取1 ml混合液加入9 ml DMEM高糖培养基稀释10倍，混匀，最终获得质量浓度分别为 1.6、1.6、1.6、6.4 mg/ml及 1.6 mg/ml的含药培养液，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，再用DMEM培养基将上述 5 种含药培养液分别作 1∶1、1∶2、1∶4 倍比稀释，各得到3种不同浓度的提取物，现用现配。

2.2 LPS刺激巨噬细胞RAW264.7构建炎症细胞模型

常规培养巨噬细胞 RAW 264.7，37℃，5%CO2，DMEM培养基（含10%热灭活胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素）。将对数生长期细胞接种至 96 孔板中，接种浓度 4×105个/ml，100 μl/孔，接种细胞总数为 4×104 个/孔，置于 5%CO2，37℃的细胞培养箱中，培养24 h后，加入含2 μg/ml LPS的DMEM培养基 100 μl/孔，LPS 刺激终浓度为 1 μg/ml，刺激 24 h。

2.3 RAW264.7细胞给药浓度筛选

通过MTT法检测药物毒性试验来确定药物最大安全剂量，筛选出适宜的给药浓度。常规培养RAW 264.7细胞，将对数生长期细胞接种于96孔板中，接种浓度 8×104个/ml，100 μl/孔，接种细胞总数为 8×103个/孔，置于含 5%CO2、37℃细胞培养箱中，培养24 h后用于实验。①对照组：每孔加入100 μl DMEM培养基（含 0.2%DMSO）；②加药组：每孔加入 100 μl“2.1.2”中配制的各种不同浓度药物，设3个复孔。药物作用 24 h后，加入 5 mg/ml现配噻唑蓝（MTT）溶液，20 μl/孔，继续培养 4 h，弃液体，拍干，加入 150 μl/孔DMSO，振荡 10 min，用酶标仪于 490/630 nm双波长下测定吸光度，每组取3孔平均数，计算细胞存活率[（A 加药组／A 对照组）×100%]，选取 90%以上细胞存活率所对应的药物质量浓度用于下一步实验。

2.4 MTT法检测RAW264.7细胞增殖活性

常规培养RAW264.7细胞，将对数生长期细胞接种于 96 孔板中，接种浓度 8×104个/ml，100 μl/孔，接种细胞总数为 8×103个/孔，置于含 5%CO2、37℃细胞培养箱中，培养24 h后用于实验。①对照组：每孔加入 100 μl DMEM 培养基；②加药组：100 μl“2.1.2”中配制的不同浓度药物，设4个复孔。药物作用24 h后，加入 5 mg/ml现配 MTT溶液，20 μl/孔，继续培养 4 h，弃液体，拍干，加入 150 μl/孔 DMSO，振荡 10 min，用酶标仪于490/630 nm双波长下测定吸光度，每组取4孔平均数，计算细胞增殖率[（A加药组-A对照组）／A对照组×100%]。

2.5 酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测RAW264.7细胞分泌NO的水平

根据“2.2”所述建立 RAW264.7巨噬细胞炎症模型，设立对照组（不加 LPS）、模型组（加入 1 μg/ml LPS诱导，每孔加入 100 μl DMEM 培养基）、药物组（加入 1 μg/ml LPS 诱导，每孔加入 100 μl“2.1.2”中配制的不同浓度药物）。设3个复孔，在37℃、5%CO2条件下培养24 h后，取细胞上清液，参照试剂盒说明书进行，570 nm处测定吸光度，计算RAW264.7巨噬细胞上清液中NO的含量。

2.6 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计学分析，计量资料用均数±标准差（

±s）表示，以 P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 RAW264.7巨噬细胞给药质量浓度的筛选结果

通过MTT法检测细胞活力，评价马齿苋不同浓度提取物对于细胞存活率的影响，结果提示，加药组的马齿苋正丁醇提取物、乙酸乙酯提取物、石油醚提取物质量浓度均在200 ～800 μg/ml，水提取物、乙醇提取物的质量浓度分别为 200 ～400 μg/ml、800 ～1600 μg/ml时，其细胞存活率均大于对照组的100%以上；水提取物、乙醇提取物的质量浓度分别为 800 μg/ml、3200 μg/ml时，其细胞存活率略低，但均大于对照组的90%以上（图1）。

图1 马齿苋提取物对RAW264.7巨噬细胞存活率的影响（n=3，

±s）

#：大于对照组存活率的90%以上；&：大于对照组存活率的100%以上。存活率大于对照组90%以上，即可以用于后续实验

3.2 马齿苋提取物对RAW264.7巨噬细胞增殖作用的影响

马齿苋正丁醇、乙酸乙酯和石油醚提取物在各种质量浓度下的细胞增殖率均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。其中，马齿苋正丁醇提取物质量浓度200、400、800 μg/ml时的细胞增殖率显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.001），质量浓度在 800 μg/ml时，其细胞增殖率达到最高，为（37.70±5.57）%。石油醚提取物的质量浓度在 400、800 μg/ml时的细胞增殖率显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.001），质量浓度在800 μg/ml时的细胞增殖率达到最高，为（57.7±4.74）%。马齿苋水提取物的质量浓度在800 μg/ml时的细胞增殖率与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05），质量浓度在 400 μg/ml时的细胞增殖率高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），质量浓度在200 μg/ml时的细胞增殖率也高于对照组，差异有统计学意义（P<0.01），其增殖率随着浓度的降低而升高。马齿苋乙醇提取物的质量浓度在800、1600、3200 μg/ml时的细胞增殖率与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表 1）。

72表1 马齿苋提取物对RAW264.7巨噬细胞增殖作用的影响（n=4，

±s）

各种浓度提取物（加药组）与对照组比较，*P<0.05，#P<0.01，&P<0.001

3.3 马齿苋提取物对RAW264.7巨噬细胞分泌NO的影响

试剂盒测定硝酸及亚硝酸盐的含量可间接反映NO的释放量，模型组的LPS刺激RAW 264.7巨噬细胞产生NO的能力明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.001），提示成功建立了炎症细胞模型。结果提示，加药组的马齿苋水提取物的质量浓度在200 ～800 μg/ml，以及正丁醇提取物质量浓度在200、400 μg/ml时，与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。加药组的乙酸乙酯提取物质量浓度在 200、400 μg/ml时，NO释放量低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。加药组的乙醇提取物、正丁醇提取物、乙酸乙酯质量浓度均在800 μg/ml，以及石油醚提取物质量浓度在400 μg/ml时，NO释放量低于模型组，差异有统计学意义（P<0.01）。乙醇提取物的质量浓度在1600、3200 μg/ml时，石油醚提取物的质量浓度在800 μg/ml时，NO释放量明显低于模型组，差异有统计学意义（P<0.001）（图2）。

图2 马齿苋提取物对LPS刺激后的RAW264.7巨噬细胞分泌NO的影响（n=3，

±s）

与对照组比较，###P<0.001；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

4 讨论

巨噬细胞在炎症中的地位尤为重要[15]，其主要作用表现在活化的巨噬细胞能够分泌炎症介质，减少巨噬细胞炎症介质的分泌是检测药物抗炎效果的一个重要因素[16]。NO是活化的巨噬细胞分泌的一种重要的炎症介质[17]，过量产生的NO在炎症反应的发生与发展中起着多种作用。研究表明，NO在类风湿性关节炎、骨关节炎、溃疡性结肠炎、癫痫、充血性心力衰竭等炎症性疾病的产生、发展过程中起重要作用[18]。此外，当NO高速率产生时，NO能与O2-结合形成过氧亚硝基阴离子[19]，可能是导致细胞损伤、能量耗竭和细胞死亡的重要因素，也是NO产生病理损伤作用的重要环节[20]。鉴于NO途径在炎症产生过程的重要作用，因此能够减少NO生成的药物，具有潜在的抗炎活性。近年采用LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7所建立的巨噬细胞炎症模型已被广泛用于确定物质抗炎活性和研究抗炎机制的模型[21-25]。抑制巨噬细胞过量分泌炎症介质NO己经成为治疗炎症反应和疾病的主要研究靶点，是炎症治疗的有效手段之一[26]。因此，本研究设计了以细胞增殖率、细胞上清中NO的分泌量为考察指标，综合评价马齿苋不同极性部位提取物对巨噬细胞增殖的影响和抗炎活性。

为了排除不同提取物可能对RAW264.7巨噬细胞产生毒性刺激，使得细胞的正常增殖因抑制而对功能评价造成偏差，本研究首先对不同提取物在细胞水平上的安全性进行了评估。MTT可通过与活细胞线粒体中的酶产生显色反应，因而可直接反映活细胞数量，并可依此测算细胞存活率。研究提示，马齿苋水提取物、正丁醇提取物、乙酸乙酯提取物、石油醚提取物之后要进行的研究浓度范围内，细胞存活率均大于对照组的90%以上。本研究中，水提取物与乙醇提取物都较易溶解，样品浓度最高可达到 3200 μg/ml，但前期研究提示，水提取物质量浓度在1600、3200 μg/ml时，细胞存活率均小于对照组的90%，因此后续并未对上述2个质量浓度展开研究。而正丁醇提取物、乙酸乙酯提取物、石油醚提取物因为较难溶解，因此实验样品的浓度最高只能达到800 μg/ml。因此，本研究对质量浓度在800 μg/ml以下的水提取物、正丁醇提取物、乙酸乙酯提取物、石油醚提取物及质量浓度在3200 μg/ml以下的乙醇提取物进行了后续研究。

本研究结果提示，质量浓度在800 μg/ml时，水和乙醇提取物没有促细胞增殖能力，而石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取物则表现出不同程度的促细胞增殖能力，推测促细胞增殖的物质极性较弱。石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取物三者相比较，乙酸乙酯提取物的促细胞增殖能力明显低于石油醚和正丁醇提取物，从极性的角度看，乙酸乙酯的极性在石油醚和正丁醇之间，然而提取物作用效果和物质的溶解规律存在不一致性，推测乙酸乙酯可能对于促细胞增殖物质具有影响作用。研究提示，水提取物质量浓度在200 ～800 μg/ml时，随着浓度的降低，其细胞增殖率随之升高，推测800 μg/ml水提物中可能含有对细胞有毒性的物质，同时也存在促细胞增殖物质，此时毒性物质的作用大于促细胞增殖物质的作用，随着毒性物质浓度降低，对细胞的毒性作用随之降低，而此时，促细胞增殖物质的作用开始大于毒性作用，渐渐表现出促细胞增殖作用。

本研究结果也提示，马齿苋乙醇、正丁醇、乙酸乙酯和石油醚提取物可以减少由LPS刺激RAW264.7巨噬细胞分泌NO（P<0.05），4种提取物随着浓度的升高，对NO的抑制作用呈现从弱到强、从无到有的现象，可能具有一定的量效关系。前期研究提示，相同质量的马齿苋原料经过提取后获得的5种提取物中，石油醚提取物的获得量是最少的，而且在800 μg/ml浓度时，其NO释放量低于模型组，差异有统计学意义（P<0.001），推测石油醚提取物是最有效的抗炎活性部位。马齿苋水提取物在浓度 200 ～800 μg/ml时，对NO没有抑制作用（P>0.05），而国内研究学者发现马齿苋水提取物具有抗炎活性[22]，推测可能是由研究材料不同所导致的，比如产地因素，另外也有可能是前期处理方法不同所导致的，本研究中的水提取物由超声提取获得的，而先前文献报道的水提取物通过煎煮法获得。本研究结果和文献报道[22]的乙醇提取物抗炎活性强于水提取物这一结论相符。

综上所述，本研究摸索了马齿苋不同极性部位提取物用于体外细胞试验的安全浓度范围，以及在安全浓度范围内不同提取物对巨噬细胞的增殖作用和对LPS诱导的巨噬细胞释放NO的抑制作用，本研究结果提示，马齿苋水、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚部位具有促巨噬细胞增殖的作用，马齿苋乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚部位能够抑制LPS刺激的巨噬细胞释放NO，因此具有潜在的抗炎活性，而石油醚部位是潜在的最有效的抗炎活性部位，这为后续抗炎物质基础研究、抗炎药物和其他抗炎产品的开发提供了理论依据。

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