李启红

山东省东营市食品药品检验中心，山东 东营 257091

[摘要]目的建立补益类中药及保健品中非法添加西地那非、氨基他达拉非、伐地那非的快速检测方法。方法采用硅胶GF254薄层板，以乙醇-正己烷（70∶30）为展开剂，展开制备薄层斑点，对斑点滴加银胶测定其SERS图谱。结果该方法用于检测3种PDE5抑制剂的专属性较好，并检测出7种补益类中药及保健品中有3种非法添加了那非类成分。结论TLC-SERS联用法简便、快速，可用于补益类中药及保健品中非法掺入的3种PDE5抑制剂的快速检测。

[关键词]中药及保健品；非法添加；PDE5抑制剂；TLC-SERS

中成药、保健品非法添加化学药品现象在我国屡见不鲜[1-2]，对食药非法添加的专项整治一直以来都是各地市食药监督稽查的重点，西地那非、他达拉非、伐地那非均为磷酸二酯酶5抑制剂，是补肾类或缓解体力疲劳类保健食品中最常添加的3种壮阳类化学成分。临床研究表明，其可以增强硝酸酯类药物的降压作用，过度服用会使心血管疾病患者受到严重伤害。

目前常用检测方法有高效液相色谱法（HPLC）[3]、液质联用法（LC-MS）[4-5]等。以上常规检测方法复杂繁琐，仪器复杂，不适于快速检测；薄层色谱法（TLC）是目前快检领域常用检测方法，具有分离与鉴定的双重功能，常用于定性初筛；表面增强拉曼光谱法（SERS）[6]是一种高灵敏、高专属的新型谱学技术，对样品纯度有一定要求，将TLC法与SERS法相结合，利用TLC法对待检成分富集，SERS法进行定性鉴别，该方法灵敏度高，数据处理简单，己广泛应用于色素、农药残留与污水中污染物等的检测研究[7-8]。

本研究采用TLC-SERS法对中成药、保健品非法添加化学药品进行研究[9-12]，优化薄层条件及SERS检测条件，以期建立非法添加化学药品的快速有效的检测方法，从而保障消费者用药安全。

便携式拉曼光谱仪（Metage，Opal3000），LDZ5-2型离心机（雷勃尔），TU-1901型紫外分光光度计（普析通用），CPX5800H-C型超声波清洗器（美国branson），ZF-6型紫外分析仪（上海嘉鹏）。

西地那非、伐地那非、氨基他达拉非对照品由中国药品生物制品检定研究院提供；硝酸银、柠檬酸三钠（AR，国药集团化学试剂有限公司）；GF254硅胶薄层板（青岛海洋化工）；实验用水为重蒸馏水；补益类中药及保健品包括百邦天元胶囊（20160802）、幸福来蛋白粉（201701001）、厚丰牌博旺胶囊（02160129）、美国一号胶囊（20151218）、喜力来胶囊（20151132）、安泰核酸原液（20160525）、龙邦原液（20160402），以上样品均来自于东营市食品药品稽查局。

2.1.1 对照品溶液的制备精密称取西地那非、伐地那非、氨基他达拉非对照品10 mg，加入甲醇-水-氨水（75∶25∶1）溶液10 ml，超声使溶解，即得。

2.1.2 模拟阳性样品溶液制备取幸福来胶囊（经检测无非法添加）一粒，分别添加10 mg（参考西地那非临床推荐剂量的1/10）上述对照品固体粉末，加甲醇-水-氨水（75∶25∶1）的溶液10 ml，超声10 min，离心5 min（3000 r/min），取上清液备用。

2.1.3 阴性样品溶液制备取幸福来胶囊一粒，加甲醇-水-氨水（75∶25∶1）的溶液10 ml，超声10 min，离心取上清液备用。

银纳米溶胶采用微波加热法配制[13]，精密称取Ag-NO3固体37 mg，置于500 ml烧杯中，加超纯水100 ml，加入1%柠檬酸三钠溶液2.6 ml，置微波炉中加热4 min，冷却备用。

取对照品溶液和样品溶液各2 μl，点于GF254硅胶薄层板上，以乙醇-正己烷（70∶30）为展开剂，氨蒸气预饱和10 min后展开，取出晾干，置254 nm紫外灯下检视定位.在阳性样品色谱条带中与对照品相同处，处滴加银胶溶液5 μl，采用拉曼光谱仪对点位进行测量，其中扫描时间设置为10 s，激光功率为75 mW。

银纳米粒子的特征可用紫外可见光谱谱峰的最大吸收位置来粗略表征，谱峰的波长越大，相应的粒子半径也越大[7]；自制银纳米粒子溶胶的紫外可见光谱中银胶溶液在423 nm处有最大吸收，可知该银胶粒径较小且均为球形纳米粒子[14-15]。

分别在薄层板三唑仑斑点上滴洒2、5、10、20、50 μl纳米银溶胶后，测其拉曼光谱，以其1169 cm-1处峰高为参考，具体见图2。结果显示，随着纳米银溶胶量的加大，样品分子拉曼图谱逐渐增大至恒定，样品分子拉曼光谱特征更加清晰。滴加量的增加有利于银胶与样品分子的结合，形成更多SERS“热点”，同时激光加热挥发部分水分使银胶浓度相对增大，使样品分子的拉曼峰加强，但由于薄层板的负载问题，滴加过多的银胶会形成咖啡环效应，扩散带走部分样品分子，使得测试结果不准确（建议测量咖啡环边缘），因此本实验选择滴洒5 μl纳米银溶胶。

薄层色谱的展开效果是检测的重要干扰因素之一，因而本研究对薄层色谱的条件进行了优化，参照相关文献方法[8]，选择了乙醇-正己烷（70∶30）分离效果较好且试剂毒性较低。西地那非、氨基他达拉非、伐地那非的RF值分别为0.51、0.70、0.85，模拟阳性样品溶液中其他组分对三种对照品斑点无干扰，阴性样品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上无斑点（图3）。

精密称取三种对照品适量，按照“2.1”项下方法制备掺伪量（质量分数）分别为2.00%、1.00%、0.40%、0.20%、0.10%、0.05%、0.01%的模拟阳性样品溶液，按照“2.3”项下方法检测，结果如图4所示。西地那非、氨基他达拉非、伐地那非的最低检出限[信噪比（S/N）3∶1]分别为0.05%、0.10%、0.05%。对应的点样沉积量分别为0.05、0.10、0.05 μg。

将实验室制备的模拟壮阳阳性样品按照“2.3”项下的方法进行检测，得到结果如图5所示。西地那非的SERS特征峰为1583、1528、1485、1399、1234、927、816、649，氨基他达拉非的SERS特征峰为1601、1500、1367、1327、1246、1166、1112、1008、927、870、817、793、757、718、689、623、584、533、477、363，伐地那非的SERS特征为1625、15871419、1396、1300124、930、817、650、542，均可对应于其固体样品的拉曼光谱中的特征信号。

采用微波加热法制备的银胶获得的3种PDE5抑制剂的SERS图谱，含有丰富的特征信息与其固体拉曼图谱一致，可用于样品的定性鉴别，准确性较高，进一步提高了对中药及保健品中非法添加3种PDE5抑制剂检测的专属性。

取百邦天元胶囊、安泰核酸原液、幸福来蛋白粉、博旺胶囊、美国一号胶囊、龙邦原液、喜力来胶囊7种样品进行检测，从薄层色谱图（图6）中可看出，样品4（美国一号）和样品6（龙邦原液）与西地那非对照品展开斑点Rf值相近处出现可疑斑点，样品7（喜力来胶囊）与氨基他达拉非对照品展开斑点Rf值相近处出现可疑斑点。可初步认定样品4（美国一号）和样品6（龙邦原液）中疑似添加了西地那非，样品7中（喜力来胶囊）疑似添加了氨基他达拉非。对上述可疑斑点滴加银胶进行SERS考察，并与相应对照品的SERS谱进行比对。结果显示，样品4（美国一号）、样品6（龙邦原液）样品的SERS谱图与西地那非对照品相一致，样品7（喜力来胶囊）的SERS谱图与氨基他达拉非对照品相一致。

在对上述7种真实样品检测过程中，薄层展开在紫外254 nm下检视，发现7号样品在与氨基他达拉非对照品相同Rf值处的斑点显色微弱，肉眼几乎不能辨别，无法定性。采集其SERS谱才出现明显的氨基他达拉非对照品的特征峰，可能是氨基他达拉非量过少，中药基质有干扰，导致目视无法定性。因此，本研究在其他样品与对照品Rf值相同处滴加银胶采集SERS谱，以降低漏检风险，最终无明显对照品特征峰，并通过HPLC方法进一步检测，判定只有4号、6号、7号样品有壮阳类成分添加，从而证明该方法的准确性。

本文建立的TLC-SERS方法成功检测出中药及保健品中非法添加3种PDE5抑制剂成分，具有良好的可行性，预处理简单，操作简便，对非法添加的现场快速检测有一定的参考意义。

[1]於洪建，吴春福.我国中药类保健食品的发展趋势[J].中草药，2016，47（18）：3342-3345.

[2]田艳平，张月琴，张敏.医院药品的风险管理[J].中国现代医药杂志，2013，11（5）：145-147.

[3]黄国栋，黄艳婷，陈林，等.补肾壮阳类中成药中非法添加物PDE-5抑制剂的分离鉴定[J].中成药，2015，37（6）：1249-1254.

[4]黄芳，吴惠勤，黄晓兰，等.高效液相色谱-串联质谱法同时测定保健品及中成药中非法添加的17种壮阳类化学药[J].色谱，2016，34（3）：270-278.

[5]刘芸，丁涛，廖雪晴，等.高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨率质谱法快速筛查中成药和保健食品中非法添加的42种化学药物[J].分析化学，2016，44（3）：423-429.

[6]左奇，陈瑶，石彩霞，等.表面增强拉曼散射光谱定量分析技术的研究进展[J].分析化学，2015，43（11）：1656-1663.

[7]翟晨，徐田锋，彭彦昆，等.基于银溶胶表面增强拉曼光谱对菠菜毒死蜱农药的快速检测[J].光谱学与光谱分析，2016，36（9）：2835-2840.

[8]文长春，覃江克，蒋庆科，等.基于银纳米表面增强拉曼光谱快速检测水果中有机硫农药残留[J].食品科技，2016，41（4）：305-309.

[9]卫程华，陈娟，许曼翎，等.表面增强拉曼光谱法快速分析中药三七的有效成分[J].江苏大学学报（医学版），2015，25（3）：263-267.

[10]李皓，朱青霞，柴逸峰，等.TLC-SERS法快速检测止咳平喘类中成药中4种添加化学成分[J].药物分析，2014，34（4）：693-697.

[11]朱青霞，曹永兵，曹颖瑛.TLC-SERS法快速检测降压类中药中非法添加的四种化学成分[J].光谱学与光谱分析，2014，34（4）：990-993

[12]谭忠谋，尹利辉，张雁.马来酸罗格列酮与盐酸苯乙双胍纳米银表面共吸附的表面增强拉曼光谱研究[J].中国药师，2013，16（6）：817-820.

[13]司民真，方炎，董刚，等.微波加热法快速制备纳米银及其SERS活性研究[J].光子学报，2008，37（5）：1034-1037.

[14]郑滨兴，吕迪亚，方芳，等.基于整体柱的表面增强拉曼光谱法检测非法染色青黛[J].药学实践杂志，2015，9（33）：426-428.

[15]李丹，汪冰，李晓，等.表面增强拉曼光谱法快速鉴别非法染色的关黄柏药材[J].药学研究，2015，34（4）：202-205.

Detection study for 3 kinds inhibitor of PDE5 illegally added into health products and traditional Chinese medicine using TLC-SERS

LI Qi-hong
Food and Drug Inspection Center of Dongying City in Shandong Province,Dongying257091,China

[Abstract]ObjectiveTo establish a rapid screenning method for tonic traditional Chinese medicines and to products with illegally added chemicals such as Sidenafil,Amino Tadalafil,Vardenafil.MethodsThe thin-layer spots was prepared by slica gel GF254 thin layer developing in ethanol-hexane(70∶30),and SERS spectrum was determined via adding silver glue on it.ResultsThis metod was applied to the detection of seven tonic traditional Chinese medicines and health products,and three were detected with sidenafil drμgs.ConclusionThis TLC-SERS rapid method is simple and rapid,and can be use to detect the three PDE5 inhibitors illegally added into tonic traditional Chinese medicine and health products.

[Key words]Health products and traditional Chinese Medicine;Illegally added;Inhibitor of PDE5;TLC-SERS

[中图分类号]R917

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2017）07（c）-0085-04

（收稿日期：2017-03-31本文编辑：祁海文）

[作者简介]李启红（1980-），男，山东临沂人，本科，主管药师，主要从事药品检验、药品质量标准、药品快速检验方法研究