吴雄健1郑虹2朱海燕1毛忠懿1张蕾1谢军1

1.赣南医学院第一附属医院消化内科，江西 赣州 341000；2.赣南医学院，江西 赣州 341000

[摘要]目的探讨骨髓间质干细胞移植后肝星状细胞凋亡情况及其治疗肝纤维化的机制。方法购买中山大学动物实验中心提供的30只清洁级SD大鼠，实验研究选取20只，将提取骨髓间质干细胞的10只作为实验组，建立肝纤维化大鼠模型，骨髓干细胞动员干预大鼠肝纤维化及肝星状细胞凋亡，检测肝纤维化及星状细胞凋亡指标；将未提取骨髓间质干细胞的10只作为对照组，不对其进行干预。然后对骨髓间质干细胞的纯度鉴定结果进行分析，并对两组大鼠的肝脏羟脯氨酸含量、肝星状细胞激活及凋亡情况进行统计分析。结果CD34、CD44、CD45、CD95阴性细胞分别为99.75%、99.51%、99.80%、95.72%。实验组大鼠CCl4皮下注射诱导8周后的肝脏羟脯氨酸含量显著高于骨髓间质干细胞移植前（P＜0.05）；实验组大鼠骨髓间质干细胞移植1周后的肝脏羟脯氨酸含量显著低于骨髓间质干细胞移植3 d后（P＜0.05），对照组大鼠骨髓间质干细胞移植1周后的肝脏羟脯氨酸含量显著高于骨髓间质干细胞移植3 d后（P＜0.05）；实验组大鼠骨髓间质干细胞移植1周后的肝脏羟脯氨酸含量显著低于对照组（P＜0.05）。实验组大鼠骨髓间质干细胞移植1周后的肝星状阳性细胞数显著少于骨髓间质干细胞移植3 d后（P＜0.05）；实验组大鼠骨髓间质干细胞移植1周后的肝星状阳性细胞数显著少于对照组（P＜0.05）。实验组大鼠骨髓间质干细胞移植3 d后的肝星状凋亡细胞数显著多于骨髓间质干细胞移植前及对照组（P＜0.05）。结论骨髓间质干细胞移植后诱导肝星状细胞凋亡可能是其治疗肝纤维化的一个主要机制。

[关键词]骨髓间质干细胞移植；肝星状细胞；凋亡情况；肝纤维化；治疗机制

肝纤维化属于一种病理表现，各种慢性肝病向一定阶段发展后均会表现出来，现阶段，临床还没有特异性的方法治疗肝纤维化及其终末阶段的肝硬化。在肝纤维化发生及缓解中，肝星状细胞激活及凋亡异常占有极为重要的地位。近年来，相关医学研究显示，在肝纤维化或肝硬化的治疗中，骨髓间质干细胞能够将一定的作用发挥出来，但是现阶段临床还未弄清楚其具体机制[1-2]。为了将有效的理论依据进一步提供给骨髓间质肝细胞对肝纤维化的治疗，本研究探讨了骨髓间质干细胞移植后肝星状细胞凋亡情况及其治疗肝纤维化的机制，现报道如下。

购买中山大学动物实验中心提供的30只清洁级SD大鼠，雌雄不限，所有大鼠均统一饲养于中山大学动物实验中心SPF层流环境中，均食用普通饲料、自由饮水。实验研究选取20只，体质量180～200 g，平均（190±10）g；提取骨髓间质干细胞10只，体质量80～100 g，平均（90±10）g。采用GIBCO公司生产的L-DEME培养液、Pharmacia公司生产的密度为1.077 g/ml的percoll淋巴细胞分离液、Thermo公司生产的小鼠抗大鼠α-SMA抗体及电热恒温CO2培养箱、hyclone公司生产的胎牛血清、santa公司生产的抗小鼠IgG-FITC荧光二抗、Roche公司生产的TUNEL试剂盒、福建迈新生物科技有限公司生产的免疫组织化学二抗试剂盒、南京建成生物工程研究所生产的羟脯氨酸测试盒。

实验研究选取20只，将提取骨髓间质干细胞的10只作为实验组，建立肝纤维化大鼠模型，骨髓干细胞动员干预大鼠肝纤维化及肝星状细胞凋亡，检测肝纤维化及星状细胞凋亡指标；将未提取骨髓间质干细胞的10只作为对照组，不对其进行干预，具体操作如下。

1.2.1 肝纤维化大鼠模型的建立采用40%四氯化碳（CCl4）溶液0.2 ml/100 g大鼠体重，皮下注射，每周2次，共6周，以建立大鼠肝纤维化模型；对照组采用等量的石蜡油代替CCl4溶液，处理方法相同。处死部分动物，留取标本，检测肝纤维化的发展情况。

1.2.2 骨髓干细胞动员干预大鼠肝纤维化及肝星状细胞凋亡肝纤维化大鼠模型建立后即刻皮下注射经稀释的重组人粒细胞刺激因子（rhG-CSF）30 μg/（kg·d）以动员骨髓干细胞，连续7 d；对照组也于肝纤维化大鼠模型建立后即刻皮下注射等量生理盐水代替rhGCSF，连续7 d。

1.2.3 肝纤维化及星状细胞凋亡指标的检测于动员后第0、7、14、28天，以过量戊巴比妥钠麻醉处死大鼠，从心脏取全血2～3 ml，离心分离血清，-80℃冻存，采用化学发光法检测血清层黏蛋白（LN）、血清Ⅲ型前胶原（PⅢP）、血清Ⅳ型胶原（ⅣC）、透明质酸（HA）等肝纤维化指标；全自动生化仪检测大鼠血清总胆红素（TBiL）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平。取大鼠肝脏组织作Masson三色染色及常规HE染色并进行图像分析，对肝组织纤维化程度及胶原纤维百分比进行观察；检测α-SMA表达及肝星状细胞的活化情况，在此过程中应用免疫组化法，α-SMA与TUNE双染法检测肝星状细胞的凋亡情况；分光光度法检测肝脏羟脯氨酸（Hyp）的含量；流式细胞仪检测活化的肝星状细胞凋亡的变化。

对两组大鼠的肝组织羟脯氨酸的含量、病理情况、肝星状细胞激活及凋亡情况进行观察和记录。

采用SPSS 20.0统计学软件对数据进行分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

CD34、CD44、CD45、CD95阴性细胞分别为99.75%、99.51%、99.80%、95.72%。

实验组大鼠CCl4皮下注射诱导8周后的肝脏羟脯氨酸含量显著高于骨髓间质干细胞移植前（P＜0.05）；实验组大鼠骨髓间质干细胞移植1周后的肝脏羟脯氨酸含量显著低于骨髓间质干细胞移植3 d后（P＜0.05），对照组大鼠骨髓间质干细胞移植1周后的肝脏羟脯氨酸含量显著高于骨髓间质干细胞移植3 d后（P＜0.05）；两组大鼠骨髓间质干细胞移植3 d后的肝脏羟脯氨酸含量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。实验组大鼠骨髓间质干细胞移植1周后的肝脏羟脯氨酸含量显著低于对照组（P＜0.05）（表1）。

实验组大鼠骨髓间质干细胞移植1周后的肝星状阳性细胞数显著少于骨髓间质干细胞移植3 d后（P＜0.05），对照组大鼠骨髓间质干细胞移植3 d后与骨髓间质干细胞移植1周后的肝星状阳性细胞数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；两组大鼠骨髓间质干细胞移植3 d后的肝星状阳性细胞数比较，差异无统计学意义（P＞0.05），实验组大鼠骨髓间质干细胞移植1周后的肝星状阳性细胞数显著少于对照组（P＜0.05）。实验组大鼠骨髓间质干细胞移植3 d后的肝星状凋亡细胞数显著多于骨髓间质干细胞移植前及对照组（P＜0.05），两组大鼠骨髓间质干细胞移植前的肝星状凋亡细胞数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

现阶段，临床还没有特异性的方法治疗肝纤维化及其终末期的肝硬化，在肝纤维化的发生及逆转过程中，肝星状细胞激活及凋亡发挥着极为重要的作用[3]。相关医学研究显示，各种损伤因素在肝脏作用后能够将肝星状细胞激活，进而造成其大量增殖，最终引发纤维化[4]。对肝星状细胞凋亡进行诱导能够对肝纤维化进行缓解[5]，而肝星状细胞凋亡水平在实验性肝纤维化大鼠自发逆转过程中随着纤维化逆转程度的加重而提升，随着纤维化逆转程度的减轻而降低，两者呈显著的正相关关系[6]。

近年来，相关医学研究显示，在纤维化疾病的治疗中，骨髓间质干细胞能够将一定的作用发挥出来[7-8]。也有相关医学研究显示，肝脏炎症损伤的发生受到注射间充质干细胞后归巢于肝脏的直接而深刻的影响，但是并不受门静脉或外周静脉等注射途径的直接而深刻的影响[9]。相关医学学者认为，磷酸鞘氨醇介导了间充质干细胞归巢于肝脏[10]。虽然也有相关医学学者提出，骨髓干细胞移植后能够为肝脏内肌成纤维细胞及肝星状细胞的形成提供良好的前提条件，其具有瘢痕形成功能，从而使肝纤维化加剧[11]。本研究结果显示，CD34、CD44、CD45、CD95阴性细胞分别为99.75%、99.51%、99.80%、95.72%。CCl4皮下注射诱导8周后两组大鼠的肝脏羟脯氨酸含量显著高于骨髓间质干细胞移植前（P＜0.05）；实验组大鼠骨髓间质干细胞移植1周后的肝脏羟脯氨酸含量显著低于骨髓间质干细胞移植3 d后（P＜0.05），对照组大鼠骨髓间质干细胞移植1周后的肝脏羟脯氨酸含量显著高于骨髓间质干细胞移植3 d后（P＜0.05）；两组大鼠骨髓间质干细胞移植3 d后的肝脏羟脯氨酸含量比较，差异无统计学意义（P＞0.05），骨髓间质干细胞移植1周后实验组大鼠的肝脏羟脯氨酸含量显著低于对照组（P＜0.05），与上述相关医学研究结果一致。

间充质干细胞能够向干细胞分化，参与肝脏损伤修复，改善肝功能，但这可能不是其对肝纤维化进行缓解的主要作用机制。由于肝脏本身较为特殊，自身成熟肝细胞分裂增殖完成了大多数的损伤修复及再生，同时，在肝细胞的再生过程中，纤维化过程中沉积下来的过量细胞外基质并不会随之降解，因此，应该有其他更为重要的基质发挥作用。临床很有必要对肝星状细胞和间充质干细胞之间的相互作用进行研究，这是因为在肝纤维化的发生、发展过程中，肝星状细胞发挥着极为重要的作用[12-15]。本研究结果显示，实验组大鼠骨髓间质干细胞移植1周后的肝星状阳性细胞数显著少于骨髓间质干细胞移植3 d后（P＜0.05），但对照组大鼠骨髓间质干细胞移植3 d后、骨髓间质干细胞移植1周后的肝星状阳性细胞数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；两组大鼠骨髓间质干细胞移植3 d后的肝星状阳性细胞数比较，差异无统计学意义（P＞0.05），实验组大鼠骨髓间质干细胞移植1周后的肝星状阳性细胞数显著少于对照组（P＜0.05）。实验组大鼠骨髓间质干细胞移植3 d后的肝星状凋亡细胞数显著多于骨髓间质干细胞移植前及对照组（P＜0.05），两组大鼠骨髓间质干细胞移植前的肝星状凋亡细胞数比较，差异无统计学意义（P＞0.05），提示间充质干细胞能够对肝纤维化进程进行缓解，同时也能够在一定程度上对炎症进行抑制，减轻炎症因子损伤干细胞程度，并为其再生提供良好的前提条件。

综上所述，骨髓间质干细胞移植后诱导肝星状细胞凋亡可能是其治疗肝纤维化的一个主要机制，值得临床充分重视。

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Exploration of the apoptosis of hepatic stellate cells after bone marrow mesenchymal stem cell transplantation and its mechanism in the treatment of hepatic fibrosis

WU Xiong-jian1ZHENG Hong2ZHU Hai-yan1MAO Zhong-yi1ZHANG Lei1XIE Jun1
1.Department of Gastroenterology,the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University,Jiangxi Province,Ganzhou 341000,China;2.Gannan Medical University,Jiangxi Province,Ganzhou341000,China

[Abstract]ObjectiveTo investigate the apoptosis of hepatic stellate cells after bone marrow mesenchymal stem cell transplantation and its mechanism in the treatment of hepatic fibrosis.Methods30 clean SD rats were purchased from Animal Experimental Center,Zhongshan University,and 20 of them were prepared for experimental research.Only ten rats whose bone marrow mesenchym stem cells were extracted and selected as the experimental group for the establishment of rat model with hepatic fibrosis.The hepatic fibrosis and apoptosis of hepatic stellate cells were intervened by bone marrow stem cell mobilization to test these indices.Another group without extraction of bone marrow mesenchymal stem cells was classified into the control group(n=10),which was not performed with intervention.The purity identification of bone marrow mesenchymal stem cells was analyzed,and the hydroxyproline content as well as hepatic stellate cell activation and apoptosis were statistically analyzed.ResultsThe percentage of CD34,CD44,CD45 and CD95 in negative cells were 99.75%,99.51%,99.80%and 95.72%,respectively.After 8-week induction via subcutaneous injection of CCl4,the content of hydroxyproline in the rat′s liver in the experimental group was significantly higher than that before transplantation(P＜0.05).In the experimental group,the content of hydroxyproline in the liver after one-week bone marrow mesenchymal stem cell transplantation was much lower compared with that 3-day after transplantation(P＜0.05).In the control group,the content of hydroxyproline in the liver after one-weekbone marrow mesenchymal stem cell transplantation was greatly higher in comparison with that 3-day after transplantation(P＜0.05).The content of hydroxyproline in the liver after one-week bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in the experimental group was remarkably lower than that in the control group(P＜0.05).The amount of hepatic stellate positive cells in the experimental group one-week after bone marrow mesenchymal stem cell transplantation was greatly less than that in the control group(P＜0.05).The amount of hepatic stellate apoptotic cells 3-day after bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in the experimental group was remarkably more than that before transplantation and in the control group(P＜0.05).ConclusionThe hepatic stellate cell apoptosis induced by bone marrow mesenchymal stem cells may be a major mechanism for the treatment of hepatic fibrosis.

[Key words]Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation;Hepatic stellate cells;Apoptosis;Hepatic fibrosis;Treatment mechanism

[中图分类号]R575.5

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2017）07（c）-0107-04

（收稿日期：2017-06-02本文编辑：祁海文）

[基金项目]江西省教育厅科学技术研究项目（150951）