黄 慧 左婷

广东省惠州市中医医院药学部，广东惠州 516001

[摘要]目的制备龙脷叶配方颗粒并测定其质量，为龙脷叶配方颗粒质量分析提供依据。方法用水煎煮方法提取生药制备龙脷叶配方颗粒；建立合适的高效液相色谱方法，采用甲醇和0.4%磷酸溶液按照48∶52的比例等度洗脱测定龙脷叶配方颗粒中的山柰酚-3-O-龙胆二糖苷含量。结果山柰酚-3-O-龙胆二糖苷的线性范围是0.1208～1.098 μg，r=1.002；相对标准偏差为1.03%。结论 本研究所建立的龙脷叶配方颗粒的制备及质量分析方法准确可靠，能够为其进一步的分析和研究打下了基础。

[关键词]龙脷叶；配方颗粒；山柰酚-3-O-龙胆二糖苷；质量分析

龙脷叶首次记载于《岭南采药录》，具有清肺止咳、抗炎镇痛、通便的疗效[1]。其主要成分包括正十八醇、β-谷甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇酸酸酯、cyclohomonervilol和山柰酚-3-O-龙胆二糖苷等[2]。20世纪70年代，龙脷叶便以“龙利叶”之名收载于《中国药典》；近些年，已出现关于龙脷叶的主要化学成分[3]、薄层色谱鉴定、龙脷叶化学成分药效学[4]、龙脷叶挥发性成分GC-MS测定[5]以及龙脷叶的质量分析[6]等方面内容的报道。《中国药典》2015年版第一部首次将龙脷叶的“含量鉴定”收载其中。但在国内仍未见到龙脷叶颗粒制备工艺、龙脷叶颗粒的鉴定以及其质量分析指标等内容的报道。本文优化龙脷叶配方颗粒制备方法，从鉴别、检查以及含量测定等方面对龙脷叶颗粒的质量进行分析，为龙脷叶配方颗粒质量分析提供依据。

1.1 仪器

日本岛津1260色谱仪（LC-20A），十万分之一天平（AB135-S，购自瑞典Mettler Toledo公司），超声波清洗器（KQ5200B，上海科导超声仪器有限公司），高速离心机（TGL-16C，上海安亭科学仪器厂）。

1.2 试药

龙脷叶药材购自北京同仁堂大药房，经专家鉴定为大戟科植物龙脷叶Sauropus rostratus的干燥叶。山柰酚-3-O-龙胆二糖苷对照品 （含量≥98.0%）购自sigma公司 （批号：20130301）。甲醇等试剂均为分析纯，实验用水为纯净水（购自娃哈哈集团有限公司）。

2.1 龙脷叶配方颗粒的制备

2.1.1 龙脷叶提取物制备工艺的筛选

本实验采用三因素三水平正交实验设计方法，以龙脷叶提取物提取率为筛选中间产物制备工艺的评定标准，以加入溶剂倍数、煎煮时间和煎煮次数为三个因素，其相应因素的三水平见表1。前期实验结果显示，Rc是影响龙脷叶提取物提取率的最主要因素；加13倍量水煎煮2次、每次1.5 h提取率最高，是龙脷叶提取物的最佳提取工艺。

表1 因素水平表

2.1.2 龙脷叶配方颗粒的制备

称取龙脷叶药材原料适量，经简单除杂后，加入13倍量蒸馏水，沸后继续煎煮1.5 h，共煎煮2次，滤过，合并滤液。于50～80℃旋转蒸发，得龙脷叶提取物；加入适量麦芽糊精，经喷雾干燥后制粒。

2.2 样品溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称定山柰酚-3-O-龙胆二糖苷对照品5.04 mg，置于100 ml容量瓶中，用50%甲醇溶解、定容，摇匀，制成0.0504 mg/ml的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备

取1 g龙脷叶配方颗粒研细，精密称定重量。将所称样品置于25 ml锥形瓶内，精密量取50%的甲醇25 ml，密闭超声40 min，补足损失溶剂，摇匀，滤过即得。

2.3 色谱条件

色谱柱采用ODS-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流动相为甲醇-0.4%磷酸溶液（48∶52）；实验过程中采用1.0 ml/min的流速，检测波长设定为349 nm。

2.4 龙脷叶配方颗粒质量分析

2.4.1 鉴别

取本品适量，研细；取样品0.50 g溶于20 ml无水乙醇中，超声30 min，滤过，滤液于水浴锅上蒸干；残渣加无水乙醇溶解定容至1 ml容量瓶，作为供试品溶液。另取龙脷叶对照药材1.01 g加60 ml蒸馏水，加热煮沸30 min，滤过，滤液于水浴锅上蒸干；残渣加无水乙醇溶解定容至20 ml容量瓶，作为对照药材溶液。将5 μl供试品溶液和15 μl对照药材溶液分别点在薄层硅胶板上，置于加有适量正己烷-乙酸乙酯（1∶4）展开剂的展开槽中，按规定步骤操作。显色剂选用10%硫酸乙醇溶液。结果显示，龙脷叶配方颗粒供试品溶液和龙脷叶对照药材溶液在薄层板中色斑的位置、数量基本一致（图1）。

 

图1 薄层色谱鉴别

A.①对照药材，②～④龙脷叶T1608078；B.①对照药材，②～④龙脷叶6076532；C.①对照药材，②～④龙脷叶6095873

2.4.2 检查

2.4.2.1 粒度 参照《中国药典》2015年版四部通则0982粒度测定法的第二法双筛分法对本品粒度进行测定。称取10.00 g龙脷叶配方颗粒，将颗粒置于10目筛进行筛动，收集不能通过的部分；将剩余的部分置于80目筛进行筛动，收集通过的部分；将收集的两部分合在一起精密称定重量为 0.6 g，所占百分比为6%，不超过15%，符合规定。

2.4.2.2 水分 参照《中国药典》2015年版四部通则0832水分测定法对本品中所含水分进行测定。称取龙脷叶配方颗粒适量，平行3份，以相同的厚度放于称量瓶的底部，于105℃下干燥至恒重。结果显示，水分分别为6.2%、5.8%、5.7%，均＜8.0%，符合规定。

2.4.2.3 溶化性 参照 《中国药典》2015年版四部通则0104项下有关规定检查。称定龙脷叶配方颗粒10 g溶于200 ml热水，持续搅拌5 min，颗粒全部溶解，符合规定。

2.5 龙脷叶配方颗粒有效成分含量测定

2.5.1 专属性考察

按“2.3”项下的色谱条件操作，山柰酚-3-O-龙胆二糖苷峰计算理论板数≥3000；山柰酚-3-O-龙胆二糖苷峰与其他成分峰达到基线分离（R＞0.05）。

2.5.2 线性关系考察

将山柰酚-3-O-龙胆二糖苷对照品溶液的进样体积依次设定为2、5、10、15、20 μl，按“2.3”项下色谱条件操作，记录峰面积。纵坐标为峰面积，横坐标为进样量，得标准曲线方程方程：y=1.432×106x-3.148×104（r=1.002）。山柰酚-3-O-龙胆二糖苷的线性范围为0.1208～1.098 μg。

2.5.3 精密度试验

精密吸取10 μl对照品溶液，于“2.3”项下色谱条件下连续进样6次。结果显示，峰面积的相对标准偏差（RSD）为0.12%，表明精密度高。

2.5.4 稳定性试验

取配方颗粒（批号：6076532）1 g制成供试品溶液，将其于室温下放置，每隔2 h进样1次，共测定6次，记录每次测定的峰面积。结果显示，峰面积的RSD为0.48%，表明在室温条件下，山柰酚-3-O-龙胆二糖苷在12 h内有很好的稳定性。

2.5.5 重复性试验

取配方颗粒（批号：6076532）1 g制成供试品溶液，平行6份，于“2.3”项下色谱条件下进样测定，得出山柰酚-3-O-龙胆二糖苷的峰面积。结果显示，该批次配方颗粒中有效成分的平均含量为0.3762 mg/g，RSD为0.14%，表明该实验方法重复性良好。

2.5.6 加样回收试验

精密称定已知含量（0.3828 mg/g）的配方颗粒（批号：6076532）0.5 g，平行6份，按“2.2.2”进行操作，分别加入4 ml山柰酚-3-O-龙胆二糖苷对照品溶液，于“2.3”项下色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表2。

表2 加样回收率结果分析

2.5.7 样品含量测定

取3批龙脷叶配方颗粒（批号：T1608078、6076532、6095873），制备成供试品溶液，分别测定3次有效成分含量（均按干燥品计算），计算平均含量，结果见表3。

表3 样品含量测定结果

3.1 制备工艺考察

在中药实验中，常考虑将水煎煮提取法作为中药提取方法，其适用范围较广泛，并且拥有较高的提取回收率[7]；近期研究发现乙醇回流提取的提取回收率也较高，在重要领域也有着较为广泛的应用。目前关于龙脷叶有效成分的提取主要包括以上两种方法[8]。水煎煮提取法所用溶剂为水，更加经济实惠，干净环保；所用设备容易操作，安全性好，更适合应用于生产，因此本实验采用水煎煮来获得龙脷叶提取物。龙脷叶配方颗粒的制备工艺采用正交试验方法对其进行筛选，以龙脷叶提取物的提取率为指标，以加入溶剂倍数（11、13、15倍）、煎煮时间（1.0、1.5、2.0 h）、煎煮次数（1、2、3次）为三因素来设计实验。结果显示，加13倍量水煎煮2次，每次1.5 h时提取率最高，优选为最佳提取工艺。本实验采用上述提取方法提取3批龙脷叶，计算得龙脷叶提取物的平均提取率为47.0%。本实验使用了喷雾干燥制粒的制备工艺，避免龙脷叶所含挥发性成分因加热干燥而造成损失。

3.2 龙脷叶配方颗粒的定性鉴别

薄层色谱鉴别几乎成为中药材和中成药首选的鉴别方法[9]。《中国药典》2015年版对龙脷叶生药材的鉴别项采用的便是薄层色谱分析方法；同时丘琴等[10]采用薄层色谱方法对龙脷叶的氨基酸与皂苷等部分进行了定性鉴别。本研究采用薄层色谱鉴别对龙脷叶配方颗粒进行定性鉴别。龙脷叶配方颗粒制成的供试品溶液与龙脷叶对照药材薄层色谱图的相同位置有相同的斑点，说明两者主要成分相同。该方法操作简单，结果可靠。同时，龙脷叶配方颗粒的各个检测项也均符合《中国药典》2015年版要求。

3.3 龙脷叶配方颗粒的定量分析

相关研究显示，龙脷叶含有皂苷类、苷类、生物碱、香豆素等多种有效成分，其中山柰酚-3-O-龙胆二糖苷在各个批次中的含量较为稳定，专属性良好[11]。同时药理学研究显示，山柰酚-3-O-龙胆二糖苷主要的药理学作用是抗炎、止咳、解痉、抗溃疡等，与龙脷叶配方颗粒在临床上的主要疗效基本一致[12-14]，具有很高程度的代表性，因此，本实验将山柰酚-3-O-龙胆二糖苷作为质量分析考察的主要指标。《中国药典》2015年版首次将山柰酚-3-O-龙胆二糖苷作为龙脷叶生药材含量测定的指标，进一步佐证了其作为龙脷叶制备颗粒质量分析指标的可行性[4]。本实验采用高效液相色谱法测定龙脷叶配方颗粒中的山柰酚-3-O-龙胆二糖苷，通过对色谱条件的考察验证，该方法专属性高，测定有效、结果可靠。

综上所述，本研究所优化的龙脷叶配方颗粒制备工艺生产效率高、操作简单、安全环保，所得产品符合药典要求，适合用于大生产过程中龙脷叶配方颗粒的制备。同时，本文所采用的薄层色谱定性鉴别方法以及高效液相色谱的定量分析方法准确可靠，操作简单，适用于龙脷叶配方颗粒的质量分析评估。

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Preparation and quality analysis of Sauropus spatulifolius Beille dispersing granules

HUANG HuiZUO Ting
Department of Pharmacy,Hospital of Traditional Chinese Medicine of Huizhou City in Guangdong Province,Huizhou 516001,China

[Abstract]ObjectiveTo prepare the Sauropus spatulifolius Beille dispersing granules and determine its quality,to provide the basis for the quality analysis.MethodsSauropus spatulifolius Beille dispersing granules were prepared by boiling water extraction method of crude drug,and the suitable HPLC method was established.The content of kaempferol -3-O-gentiobioside of Sauropus spatulifolius Beille dispersing granules was determined by using methanol and 0.4% phosphoric acid solution in accordance with the proportion of 48∶52.ResultsThe linear range of kaempferol-3-O-gentiobioside was 0.1208-1.098 μg,r=1.002.The relative standard deviation was 1.03%.ConclusionThe preparation and quality analysis method of Sauropus spatulifolius Beille dispersing granules established in this study is accurate and reliable,it can lay a foundation for further analysis and research.

[Key words]Sauropus spatulifolius Beille;Dispersing granules;Kaempferol-3-O-gentiobioside;Quality analysis

[中图分类号]R927.11

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2017）05（c）-0090-04

（收稿日期：2017-03-28 本文编辑：祁海文）