夏洪波1陈珺汝1郭锦锦2唐艳丽2孙万邦2▲

1.深圳市龙岗区妇幼保健院儿童保健科，广东深圳518172；2.遵义医学院珠海校区免疫学教研室，广东珠海519041

[摘要]目的检测儿童新甲型（H1N1）流感疫苗接种后其远期疫苗活化Th1/Th2细胞因子分泌水平的变化情况。方法选取本院2009年12月～2010年1月收治的自愿接受新甲型H1N1流感疫苗接种的31名健康儿童，取3 ml外周血分离淋巴细胞，分别设新甲型H1N1流感疫苗刺激组（实验组）和正常细胞组（对照组），进行细胞培养后，采用流式CBA法及ELISA法检测Th细胞因子分泌水平。结果流式CBA技术检查显示，试验组的TNF-α、IL-10水平明显低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。ELISA方法检测显示，两组的TNF-α、IL-4水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；实验组的IL-10水平显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。对照组和实验组流式CBA方法检测的IL-10水平明显高于ELISA方法检测结果，差异有统计学意义（P＜0.05），且两种方法检测结果的相关性具有统计学意义，分别得到回归方程Y=206.59+0.082X和Y=136.70+0.168X。结论新甲流疫苗再次刺激未能很好地活化Th1及Th2细胞，即未产生较好的Th1型细胞免疫反应和较好的体液免疫，提示新甲流疫苗特异性免疫记忆功能欠佳；流式CBA方法与传统ELISA方法检测细胞因子均具有较高的灵敏度且具有相同的结果规律。

[关键词]新甲型H1N1流感疫苗；Th1/Th2细胞因子；儿童；免疫记忆

当机体再次遭受曾经作出过免疫应答的特定抗原刺激时，能够快速鉴别并作出反应，这种能力被称为免疫记忆，是机体免疫的重要特征[1]。免疫记忆的存在与预防再次罹患疾病或降低疾病影响程度密切相关[2]。同时，预防接种的主要目标之一就是能够促使机体产生持久的免疫记忆，这对于疫苗的设计和研发意义重大[3]。2009年，我国在采取接种新甲型H1N1流感疫苗（以下称“新甲流疫苗”）的措施下，新甲流疫情得到了有效控制。大量研究资料显示，新甲流疫苗有较好的免疫原性，体液免疫较好[4]。为了解新甲流疫苗接种后的远期免疫记忆效果，本研究采用ELISA法及流式CBA法检测并分析儿童新甲流疫苗接种4年后再次接受新甲流疫苗刺激Th1/Th2细胞因子的分泌情况，旨在为该疫苗免疫原性和研发新型疫苗提供理论依据。

1.1 一般资料

2013年12月21日，在儿童监护人知情同意的前提下，择取31名7～10岁并在2009年12月～2010年1月于深圳市龙岗区妇幼保健院接受1剂次（15 μg）新甲流疫苗上臂外侧三角肌注射的儿童为研究对象，且疫苗接种后至研究期间均未接种过其他流感疫苗、未曾患有肺炎等严重呼吸系统疾病。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂本研究中所用试剂包括大连雅立峰生物制药有限公司生产的新甲流疫苗、美国Thermo Fisherser公司生产的RPMI-1640培养液以及FBS胎牛血清等，所用试剂盒包括博士德生物科技有限公司生产的IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α ELISA试剂盒和美国BD公司生产的HU IL-10及TNF-α CBA试剂盒。

1.2.2 仪器本研究中所用仪器包括美国Bio-TEK公司生产的ELx-800型酶标仪、美国Becton Dickinson公司生产的FACS Calibur流式细胞仪、美国Becton Dickinson公司生产的SW-CJ-2F型双人双面净化工作台、安徽中科中佳科学仪器有限公司生产的台式离心机以及台式高速离心机、美国ThermoFisherser生产的CO2培养箱、德国莱卡公司生产的倒置光学显微镜、上海精宏试验有限公司生产的DK-S24恒温水浴箱等。

1.3 方法

1.3.1 淋巴细胞分离抽取研究对象外周静脉血3ml，肝素抗凝，立即送入超净工作台，采取同体积D-Hank液稀释，再使用淋巴细胞分离液和离心机进行20 min离心（2000 r/min），获取淋巴细胞，用D-Hank液充分洗涤后，加入RPMI-1640培养液调整淋巴细胞数为1×106/ml。

1.3.2 细胞培养将淋巴细胞悬液加入96孔培养板中，每一份样本设新甲流疫苗刺激组（实验组），每孔分别加入新甲流疫苗10%FBS-RPMI 1640培养液100 μl（浓度为3 μg/ml新甲流疫苗）；正常细胞组（对照组）每孔分别加入相同培养液，置于细胞培养箱中培养50 h。培养结束后，将96孔培养板进行5 min离心（800 r/min），采用ELISA及CBA方法检测上清液细胞因子浓度。

1.3.3 CBA方法检测细胞因子采用Assay Diluent稀释冻干的细胞因子标准品，制备浓度梯度细胞因子标准品及阴性指控管（0 pg/ml）；混合细胞因子捕获微球，充分涡旋混匀，室温200×g离心5 min，置入与其体积相同的血清增强液，再次涡旋混匀后对其进行孵育，时间持续30 min，条件为室温、避光。加入标准品、样本及PE标记的细胞因子检测抗体，室温避光孵育3 h；清洗样本，重悬细胞，立刻使用流式细胞仪器进行检测，采用FCAP Array v1.0特定软件对收集数据（FCS2.0格式）进行处理和分析。

1.3.4 ELISA法检测细胞因子选做奇数号样本16份，在酶标板设10个稀释度，加待测样品孔，设空白对照孔；经过温育、洗涤、酶标等步骤处理后进行上机检测，分别取得各孔吸光度[D（λ）]数据，再计算得出对应的每一份样品各细胞因子浓度。

1.4 统计学处理

采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行分析，采用Kolmogorov-Smirnov检验来明确样本数据的分布状态，采用Wilcoxon符号秩和检验或配对t检验检测差异显著性，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 两组流式CBA法检测TNF-α水平的比较

本研究中，淋巴细胞培养后上清液中TNF-α水平采用流式CBA检测的流式检测散点图见图1，经检验，所得样本TNF-α浓度呈非正态分布。实验组和对照组的TNF-α浓度中位数分别为6.54 pg/ml和90.41 pg/ml，实验组明显低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。通过Wilcoxon符号秩和检验，其中，实验组＜对照组共29例，秩均值为16.24，P=0.000；实验组＞对照组共2例，秩均值为12.50，P=0.000；实验组=对照组0例。

2.2 两组流式CBA法检测IL-10水平的比较

淋巴细胞培养后上清液中IL-10水平采用流式CBA方法检测的流式检测散点图见图2，经检验，对照组样本IL-10浓度数据呈非正态分布。实验组和对照组的IL-10浓度中位数分别为199.82 pg/ml和1704.56 pg/ml，实验组明显低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。通过Wilcoxon符号秩和检验，其中，实验组＜对照组共31例，秩均值为16.00，P=0.000；实验组＞对照组、实验组=对照组均为0例。

 

图1 标准品与1号标本流式检测散点图

 

图2 标准品与1号标本流式检测散点图

2.3 两组ELISA法检测IFN-γ、TNF-α水平的比较

采用ELISA方法检测16份奇数号样本细胞培养后的IFN-γ、TNF-α水平，结果显示，两组的IFN-γ、TNF-α水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

表1 两组ELISA法检测Th1细胞因子IFN-γ、TNF-α水平的比较（pg/ml，s）

2.4 采用ELISA法检测IL-4、IL-10水平的比较

采用ELISA方法检测16份奇数号样本细胞培养后的IL-4、IL-10水平，结果显示，两组IL-4水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；两组的IL-10水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

表2 采用ELISA法检测Th2细胞因子IL-4、IL-10水平的比较（pg/ml，s）

 

与对照组比较，*P＜0.05

2.5 流式CBA法与ELISA法检测IL-10的相关性分析

目前认为，流式CBA法检测细胞因子较ELISA方法灵敏。本研究分别对16份奇数号样本实验组和对照组采用流式CBA法与ELISA法检测IL-10的结果进行相关性分析，结果显示，四组样本IL-10浓度均呈正态分布。采用配对t检验，两种方法检测IL-10水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）（表3）。分别对对照组和实验组两种方法所得的IL-10浓度数据进行相关分析，得出相关系数r分别为0.875、0.812，采用Pearson分析，差异均有统计学意义（P＜0.01），提示两种方法成正相关。使用简单回归分析同样得出，CBA方法检测对照组和实验组IL-10水平与ELISA方法检测结果的相关性具有显著统计学意义，分别得到回归方程Y=206.59+0.082X和Y=136.70+ 0.168X，经F显著性检验，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 CBA、ELISA两种法检测细胞因子IL-10水平的比较（pg/ml，s）

 

与同组ELISA法比较，*P＜0.05

免疫记忆细胞在人体免疫细胞群中有非常重要的作用，是形成细胞免疫记忆的基础[5]，而记忆T细胞在人体免疫细胞中就发挥着识别、记忆特异性抗原的作用[6]。大量研究显示，记忆B细胞和记忆T细胞（Tm）的存在已是普遍共识[7-10]，其中记忆B细胞能够持续分泌出协助机体抵御外来微生物侵袭的特异性抗体，而T细胞介导的免疫应答对胞内感染的微生物如新甲型H1N1流感病毒等的防御更为重要[11]。许多研究均已证实，在抗原和MHC分子缺乏的情况下Tm可以长期存在[12]，Tm（CD4+Tm和CD8+Tm）根据表型、功能及组织分布的不同可分为中枢记忆性T细胞（Tcm）和效应记忆性T细胞（Tem），血液中均有主要分布[13]。当特异性Tm再次受抗原刺激时，Tem反应迅速，能够快速产生细胞因子参与免疫应答；而Tcm则不同，其增殖反应较强，并产生效应细胞，维持长期保护力[14]。

CD4+T细胞在被激活后，不仅可以分化出功能迥异的细胞，并且能够分泌出多种具有不同生物活性的细胞因子，一般传统上，据此将其区分成Th1和Th2细胞两个亚群。Th1细胞中包含了IL-2、IFN-γ及TNF-α等细胞因子，其在人体中的主要作用为提升人体细胞的免疫功能，是人体细胞自主抵抗胞内病原体感染、肿瘤细胞感染的重要因子。以IFN-γ因子为例，其作为Th1细胞的代表性因子，本身也是一种非常重要的炎性因子，对细胞免疫调节、抑制病毒扩散、激活巨噬细胞、提升靶细胞杀伤能力等均有重要作用，同时其能有效提升Th1细胞的增殖速度而抑制Th2细胞分泌、促进B细胞分化及产生抗体等，IFN-γ的分泌水平直接反映机体细胞免疫情况；TNF-α则能通过激活T细胞，促进IL-2等因子的产生[15]，其本身同样属于强作用的致炎因子系列，在人体中具有细胞防御、免疫保护的效果，能够有效发挥人体抗感染作用。Th2细胞分泌的细胞因子可协助B细胞产生体液免疫反应，在抵御细胞外微生物感染过程中起到巨大作用，主要包括IL-4及IL-10等因子。以IL-4细胞因子为例，其本身作为Th2细胞的特征性细胞因子，对提升T细胞抗原提呈作用、促进IgG中和作用发挥均有重要作用，是细胞免疫因子、体液免疫因子之间沟通联结的重要桥梁；而IL-10本身则属于免疫抑制性因子类型，在机体自身免疫耐受的维持方面及感染性疾病中发挥调节免疫作用。IL-10虽然也是炎性因子，但由于其在人体中水平较低的原因，正常情况不会出现较高水平的表达，因此能有效发挥机体的自我保护作用[16]。接种特定疫苗促使机体产生特异性Tm获得长期免疫记忆这一过程已被证明是相对不易的[17]。本研究采用CBA技术测定TNF-α水平，结果显示实验组TNF-α浓度显著低于对照组；采用ELISA方法检测TNF-α和IFN-γ两种Th1细胞因子，结果差异无显著性；以上结果均提示新甲流疫苗再次刺激未能很好地活化Th1细胞，从而刺激IFN-γ等相关因子的分泌，即未产生较好的Th1型细胞免疫反应。通过CBA和ELISA两种方法，检测出对照组IL-10水平显著高于实验组，且两组IL-4浓度差异亦无显著性，显示特异性Th2细胞也未得到很好的激活，未能产生较好的体液免疫。

综上所述，31例儿童接种新甲流疫苗4年后的正常细胞具有良好的Th1/Th2细胞因子分泌功能，但疫苗特异性免疫记忆功能不强，远期免疫记忆效果欠佳。这与同期研究结果（接种新甲流疫苗后产生的特异性记忆T细胞量少，且不具备针对新甲流病毒抗原再次发挥特异性免疫应答的能力）相一致[18]。为了达到接种新甲流疫苗能够取得良好免疫记忆的目的，需进一步深入研制新型疫苗。另外，通过比较流式CBA法和传统ELISA方法检测IL-10水平并进行相关性分析，结果显示流式CBA方法与传统ELISA方法检测细胞因子结果均具有较高的灵敏度且具有相同的结果，采用ELISA方法检测实验组和对照组TNF-α水平无显著性差异，采用流式CBA检测所得数据显示有显著性差异考虑与此有关。

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Analysis on secretion levels of long-term vaccine activation of Th1/Th2 cytokine after new influenza A(H1N1)vaccination in children

XIA Hong-bo1CHEN Jun-ru1GUO Jin-jin2TANG Yan-li2SUN Wan-bang2▲
1.Department of Child Health Care,Maternal and Child Health Care Hospital of Longgang District in Shenzhen City, Shenzhen518172,China;2.Teaching and Research Section of Immunology,Zhuhai Campus,Zunyi Medical College, Zhuhai519041,China

[Abstract]Objective To test the changes of secretion levels of long-term vaccine activation of Th1/Th2 cytokine after new influenza A(H1N1)vaccination in children.Methods A total of 31 healthy children who were on their own willing for new influenza A(H1N1)vaccination from December 2009 to January 2010 in our hospital were selected,lymphocyte cells were separated from 3 ml peripheral blood for culture,and then were divided into new influenza A(H1N1)stimulation group(the experimental group)and normal cell group(the control group).The levels of Th cytokine secretion were measured by flow CBA and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Results The technical examination of the flow CBA showed that the levels of TNF-α and IL-10 in the experimental group was significantly lower than those in the control group,with significant difference(P＜0.05).The ELISA method displayed no significant difference in the level of TNF-α and IL-4 between the experimental group and the control group(P＞0.05).The level of IL-10 in the experimental group was significantly lower than that in the control group,which was in statistical differences(P＜0.05).The levels of IL-10 in both the control group and the experimental group tested by flow CBA was significantly higher than those by the ELISA test, with statistical differences(P＜0.05).The correlation of test outcomes by the two methods was displayed a statistical significance in equation of Y=206.59+0.082X and Y=136.70+0.168X respectively.Conclusion Re-stimulation of new influenza A H1N1 vaccine cannot activate Th1 and Th2 cells in a great success,that′s to say,no satisfactory Th1 cellular immune response and humoral immunity suggesting that the specific immune memory function of the new influenza AH1N1 is poor.The higher sensitivity and the same test results are obtained by flow CBA and the traditional ELISA method in detecting cytokines.

[Key words]New influenza A H1N1 vaccine；Th1/ Th2 cytokine；Children；Immune memory

[中图分类号]R511.7

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2017）03（a）-0011-05

（收稿日期：2016-12-23本文编辑：祁海文）

[基金项目]广东省深圳市龙岗区科技计划医疗卫生项目（20140 6093001035）

▲通讯作者：孙万邦，硕士生导师，主要从事分子与临床免疫学研究