张晓东1姚 芳2

1.内蒙古食品药品检验所化药室，内蒙古呼和浩特 010010；2.内蒙古自治区第四医院药剂科，内蒙古呼和浩特 010010

[摘要]目的 通过高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS/MS）建立结核性脑膜炎患者脑脊液中利福霉素钠的测定方法。方法 采用XTerraMS C18色谱柱（4.6 mm×100.0 mm，3.5 μm），以醋酸铵（0.01 mol/L）-甲醇（10∶90）为流动相，流速为0.4 ml/min。经HPLC分离，以多反应监测（MR M）测定。结果 本方法在0.4～4.0 μg/ml浓度范围内线性良好（r=0.9997）；检出限为100 ng/ml。结论 本方法操作简单，结果准确，可用于结核患者脑脊液中利福霉素钠含量测定。

[关键词]高效液相色谱-质谱联用；结核性脑膜炎；脑脊液；利福霉素钠

结核病，又称痨病，是一种古老的传染病，它曾在世界范围广泛流行，并夺取数亿人的生命。自1944年发现链霉素对结核分枝杆菌有效及1962年利福霉素应用于临床以来，异烟肼等大量抗结核药物的出现，开创了以利福霉素、利福平、异烟肼为主的结核化疗时代，并使流行得到了一定的控制。结核性脑膜炎（tubercular meningitis，TBM）是由于结核分枝杆菌感染所致的中枢神经系统感染性疾病，是结核病中最严重的一种，若治疗不及时，可导致严重的神经系统并发症，最终引起患者死亡或遗留严重后遗症[1]。

治疗药物监测（therapeutic drug monitoring，TDM）是应用现代分析技术测定患者体液中的药物及其代谢产物浓度，以优化设计或调整给药方案，以实现个体化治疗，提高疗效，减免毒副作用的药学技术方法[2]。TDM是近代临床药物治疗划时代的重大进展之一，也是结核化疗中的一个新的发展方向。血药浓度监测只是TDM的一个重要组成部分。本课题拟建立测定抗结核药物利福霉素在TBM患者脑脊液中浓度的方法并进行分析，制订合理的给药方案，以避免药物过量引起的不良反应及药物不足导致的治疗失败，也为今后其他项目（尿药浓度、痰药浓度、胸腹水药物浓度等）的TDM工作提供依据。

质谱仪：美国AB公司API3200LC-MS/MS质谱仪；液相色谱仪：日本岛津公司LC-20A型高效液相色谱仪，大气压化学电离源[3]；流动相为醋酸铵（0.01 mol/L）-甲醇（10∶90），醋酸铵、甲醇为色谱纯，利福霉素钠为标准品。

2.1 分析条件

2.1.1 液相色谱条件 色谱柱：沃特世公司C18柱，标准：4.6 mm×100.0 mm，3.5 μm；流动相：0.01 mol/L的醋酸铵-甲醇（10∶90）；流速：0.4 ml/min；柱温：室温。

2.1.2 质谱条件 减簇电压（DP）：95 V；碰撞室入口电压（CEP）：20 V；Q1入口电压（EP）：8.0 V；碰撞室出口电压（CXP）：20 V；离子源电压（IS）：5500 V；碰撞电压（CAD）：8.0 V；离子源：APCI，ESI；扫描方式：正离子扫描；温度（TEM）：500℃；气帘气（CUR）：20 psi；GS1：50 psi；GS2：50 psi；MRM：719.9/688.2，CE：35 V；MRM：719.9/660.1，CE：40 V；MRM：719.9/295.0，CE：62 V[4-6]。

2.2 溶液制备

2.2.1 利福霉素钠标准储备液制备 称取利福霉素钠对照品0.010 03 g，置100 ml量瓶中，配制为100.3 μg/ml的溶液。

2.2.2 利福霉素钠工作溶液制备 取利福霉素钠标准储备液，置10 ml量瓶中，加甲醇-水（50∶50）溶液稀释至刻度，摇匀，得10.03 μg/ml的工作溶液。取10.03 μg/ml的利福霉素钠工作溶液1 ml置100 ml量瓶中，加甲醇-水（50∶50）溶液稀释至刻度，摇匀，得100.3 ng/ml的工作溶液。

2.3 样品的来源和制备

2.3.1 样品的来源 TBM患者脑脊液：2016年1～6月在内蒙古第四医院住院的TBM患者，住院期间行腰椎穿刺术取脑脊液。

2.3.2 样品的制备 取患者脑脊液1 ml置15 ml塑料离心管中，精密加甲醇-水溶液（50∶50）4 ml，涡旋3 min，溶液经微孔滤膜（0.45 μm）过滤后，供液相色谱串联质谱仪测定[7]。

2.4 LC-MS/MS的条件

2.4.1 LC-MS/MS的条件选择 筛选不同的液相色谱柱及色谱、质谱条件[8-11]，最后确定为“2.1”项下的液相色谱串联质谱条件检测利福霉素钠，应用“2.1”项下的色谱-质谱条件进行分析。

2.4.2 标准曲线 取2 μg/ml的标准溶液，分别进样1、2、4、5、6、8、10 μl，用“2.1”项下的LC-MS/MS条件进行测定，得到定量离子对719.9/688.2的峰面积。以测定浓度（X，μg/ml）为横坐标与峰面积（Y，counts）为纵坐标进行线性回归分析，线性方程为Y=5.22e+004X-1.52e+003（r=0.9997）。结果见表1、图1，提示利福霉素钠在0.4～4.0 μg/ml范围内线性关系良好。

表1 标准曲线试验

 

图1 利福霉素钠标准曲线

2.4.3 检测限 将100 ng/ml的利福霉素钠工作溶液进样5 μl，得信噪比S/N=3.6，该方法的检出限为100 ng/ml。

2.4.4 精密度试验 将利福霉素钠制成0.4 g/ml的标准溶液6份，分别通过“2.1”项下的方法检测，得到的峰面积分别为19 754、18 965、20 038、18 997、19 765、18 661（RSD=2.9%），方法精密度较好。

2.4.5 稳定性试验 将0.8 μg/ml的利福霉素钠标准溶液分别于0、1、4、8、12、24 h分别进样5 μl。采用上述液相色谱串联质谱条件进行分析，得到峰面积分别为38 970、41 120、40 665、38 385、38 100、36 919（RSD= 4.1%），显示利福霉素钠在24 h内稳定。

2.4.6 实际样品的测定试验 以时间（min）为横坐标，以响应浓度（cps）为纵坐标，分别做阴性对照色谱图及利福霉素钠对照品色谱图，分别见图2、3，应用本方法测定6例不同TBM患者脑脊液中利福霉素钠的量分别为0.51、0.43、0.40、0.68、0.35、0.28 μg/ml。

 

图2 阴性对照色谱图

 

图3 利福霉素钠对照品色谱图

利福霉素为半合成的广谱抗菌素，它对分枝杆菌，特别是对结核菌有强力的抑菌作用。利福霉素行静脉注射或局部应用效果较好，口服几乎不能达到有效的血药浓度；药代动力学方面，单次静脉滴注利福霉素钠0.5、1.0、2.0 g后的血药峰浓度 （Cmax）分别为28、46、90 mg/L，1 h后即下降至50%左右。每6小时静注利福霉素钠0.5 g，稳态血药浓度为36 mg/L。血浆蛋白结合率＜5%。血液消除半衰期（t1/2）为3～5 h[12]。该药在脑脊液中的分布情况及浓度少见详细报道，希望通过该项研究，弥补脑脊液中利福平、利福霉素药物浓度测定的不足，为进一步研究血液、脑脊液中药物代谢情况提供技术支持[13]。

同时，利福霉素的杀菌能力与药物在病灶区域的浓度有密切关系，但其具有肝脏毒性、胃肠功能紊乱、神经系统症状、血小板减少症和变态反应等严重的毒副作用[14]。因此，本课题通过监测生物体液中药物的浓度，以达到最佳治疗效果，并尽量减少毒副作用，具有重要的临床意义。

液质联用技术在分析药物及其在各种复杂生物基质（全血、血浆、尿、胆汁及生物组织）中的代谢产物时，由于其选择性强、灵敏度高，不仅可以避免复杂、繁琐、耗时的样品前处理工作，而且能分离鉴定以往难于辨识的痕量药物代谢产物，尤其是串联质谱（MS/ MS）的应用，通过多反应监测（MRM），可以大大提高分析的专一性，改善信噪比，提高灵敏度，从而快速、方便地解决问题[15]。

本研究采用液质联用的方法对TBM患者脑脊液中利福霉素进行检测，具有方法灵敏、准确、稳定性好等优点。脑脊液中药物浓度监测只是TDM中的一个重要组成部分。本课题通过建立结核药物监测的方法并进行药动学分析，以制订合理的给药方案，为今后其他药物治疗学监测工作提供依据。

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Determination Rifamycin sodium in the cerebrospinal fluid of patients with tuberculous meningitis

ZHANG Xiao-dong1YAO Fang2
1.Medicine Chamber,Inner Mongolia Institute for Food and Drug Control,Hohhot 010010,China;2.Department of Pharmacy,the Fourth Hospital of Inner Mongolia Autonomous R egion,Hohhot010010,China

[Abstract]Objective To establish a method for determination R ifamycin sodium in the cerebrospinal fluid of patients with tuberculous meningitis by HPLC-MS/MS.Methods Column was XTerraMS C18（4.6 mm×100.0 mm,3.5 μm）.Mobile phase was Ammonium acetate (0.01 mol/L)-Methanol(10:90).Flow rate was 0.4 ml/min.Multiple reaction monitoring (MR M)was used by HPLC.Results The linear ranges of 0.4-4.0 μg/ml(r=0.9997)was better;Detection limit was 100 ng/ml. Conclusion The method is simple,rapid,accurate,and it can be used for therapeutic drug monitoring.

[Key words]HPLC-MS/MS;Tuberculous meningitis;Cerebrospinal fluid;R ifamycin sodium

[中图分类号]R969

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2017）02（b）-0012-03

（收稿日期：2016-12-23 本文编辑：方菊花）

[基金项目]内蒙古自治区医疗卫生计生科研计划项目（2013 03027）