陈震尧1刘 燕2▲

1.广东省肇庆市中医院制剂室，广东肇庆 526020；2.肇庆医学高等专科学校药学系，广东肇庆 526020

[摘要]目的筛选山芪补肾消渴丸的最佳提取工艺条件。方法采用正交试验法，以续断皂苷Ⅵ的提取率和总固体物收率作为考察指标，针对对提取影响较大的加水量、提取次数、提取时间三因素进行考察，从而确定一个较为合理的提取工艺，根据研究结果进行三批中试，验证提取工艺的可行性及产品质量的稳定性。结果实验证明，正交试验优选出的最佳提取工艺条件是药材饮片加水煎煮提取2次，每次加8倍水，第1次提取2 h，第2次提取1.5 h。结论山芪补肾消渴丸优选出的提取条件经稳定性验证是可行的，适合大批量生产。

[关键词]山芪补肾消渴丸；提取工艺；正交试验；川续断皂苷Ⅵ；总固体物收率

山芪补肾消渴丸由山药、黄芪、山茱萸、芡实、莲子、太子参、续断、五味子、白术、诃子、肉豆蔻、荷叶组成，具有健脾益气、补肾涩精止漏功效，主治脾肾两虚、肾阴亏虚、阴阳两虚型的糖尿病。本制剂为浓缩丸，根据处方药物性质及资料研究，本研究拟对处方中的黄芪[1]、荷叶[2]、诃子[3]、续断[4]、太子参[5]、五味子[6]、肉豆蔻[7]等七味药物加水煎煮提取，采用正交试验法，优选最佳提取工艺并进行中试试验验证其可行性。

1.1 仪器

WATERS-515型高效液相色谱仪 （美国沃特世公司），FA1004N电子天平（上海精密科学仪器有限公司），KQ5200DE型台式数控超声波清洗器（东莞科桥超声波设备有限公司），JC101型电热鼓风干燥箱（上海成顺仪器光有限公司），立式万用电炉（上海浦东荣丰科学仪器有限公司）。

1.2 试药

川续断皂苷Ⅵ（中国药品生物制品检定所，批号：111685-201304）；药材购自肇庆得隆中药饮片厂，经鉴定均符合《中国药典》2015年版一部各项下有关规定；甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯，水为纯化水。

2.1 提取工艺的确定

主要根据处方各药有效成分的理化性质及其药理作用，同时考虑临床需要、生产可行性以及生产设备等方面的因素设计工艺流程，拟采用加水煎煮提取工艺。

2.2 正交试验设计

2.2.1 因素水平选择

影响提取结果的因素很多，主要有加水倍量、提取次数、提取时间等，本研究采用正交试验法，选取加水量（A）、提取次数（B）、提取时间（C）作为考察因素[8]，每个因素设计3个水平，进行L9（34）正交试验，筛选出最佳的工艺条件。因素水平见表1。

表1 因素水平

2.2.2 考察指标的确定

续断为方中主要药味，主要成分为三萜皂苷类[9]，具有抗炎镇痛作用[10]。设计本实验方案时，选取HPLC法测定水提取液中川续断皂苷Ⅵ的含量，其为重要的考察指标，权重系数定为0.6；水提取液中总固体物（即干膏得率）作为浸膏总有效成分考察的另一个指标，权重系数定为0.4，以两者的结果进行综合评分，考察加水倍量、提取次数、提取时间三因素对提取工艺的影响，优选出最佳的工艺参数。

2.3 正交试验的实验方法

2.3.1 样品的制备

按处方比例称取诃子、肉豆蔻、续断、黄芪、荷叶、五味子、太子参等药材，按实验方案设定的方法提取，过滤，滤液静置过夜，取上清浓缩至适量，定容至1000 ml，备用。

2.3.2 续断皂苷Ⅵ含量测定

2.3.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Extend C18柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（30∶70）；检测波长：212 nm；流速：0.8 ml/min；柱温：25℃[11]。

2.3.2.2 对照品溶液的制备 精密称取川续断皂苷Ⅵ对照品15 mg，置于10 ml量瓶中，加甲醇摇匀使全部溶解，稀释至刻度，摇匀，精密吸取1.0 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得对照品溶液，浓度为0.15 mg/ml。

2.3.2.3 供试品溶液的制备 将提取液浓缩并定容至1000 ml的样品，精密量取0.7 ml置于10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，称定重量，超声处理30 min，放冷，用甲醇补足损失的重量，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3.2.4 标准曲线的制备 精密吸取川续断皂苷Ⅵ对照品溶液3、5、10、15、20 μl进样，按上述色谱条件进样测定，记录峰面积，以峰面积积分值为纵坐标（Y），对照品溶液进样量为横坐标（X），按最小二乘法进行回归，得回归方程为Y=274X-4910，r=0.9999，显示川续断皂苷Ⅵ在0.45～3.00 μg范围内线性关系良好（图1）。

 

图1 川续断皂苷Ⅵ标准曲线

2.3.2.5 样品含量的测定 精密吸取各正交试验设计的供试品溶液各10 μl，按上述色谱条件进样测定，记录色谱图，根据供试品吸收度积分值与对照品积分值，采用外标两点法计算，即得。

2.3.3 干膏得率的测定

精密吸取实验方案中各样品浓缩液10 ml，置于已恒重的蒸发皿里，水浴蒸干，按照干燥失重测定法[12]103测定，计算干膏得率，公式如下：

W为各样品10 ml浓缩液中干浸膏重量，V为定容体积，Wt为饮片重量。

2.3.4 评价指标综合评分

根据“2.2.2”项下考察指标的确定，以水提液中续断皂苷Ⅵ的含量和总固体物的收率为指标，采用公式[Y=（60/续断皂苷Ⅵ含量max）×续断皂苷Ⅵ含量+（40/得膏率max）×得膏率][13]计算综合评分，采用SPSS 12.0统计学软件对数据进行处理。

2.4 正交试验结果及分析

2.4.1 实验结果

取“2.3.1”项下制备好的样本，按正交表设定条件及上述实验方法试验，正交试验安排及结果见表2，方差分析结果见表3。

表2 正交试验结果

表3 方差分析结果

 

F0.01（2.4）=18.00，F0.05（2.4）=6.94，F0.10（2.4）=4.32

2.4.2 结果分析

对正交试验结果作直观分析，结合方差分析，判断各因素对提取效果的影响程度，筛选出最佳的提取条件。由表2的实验结果可知，对提取效果有影响的因素顺序为提取次数（B）＞提取时间（C）＞加水倍量（A），由此得到的最佳工艺条件为A2B3C3。由表3的方差分析可知，提取次数（B）对提取结果有显著性影响，提取时间（C）对提取结果有一定影响，而加水倍量（A）对实验结果无显著性影响。提取次数之间的主要差异体现在提取1次和提取2次之间，通过综合分析，认为以缩短生产周期，降低生产成本等综合因素为宜，选择A1B2C3作为本实验的最佳提取工艺条件，即药材饮片加水回流提取2次，每次加8倍水量，第1次提取2 h，第2次提取1.5 h。

2.5 稳定性试验

为确定本工艺的优劣与稳定性，依据上述分析优选出的最佳工艺条件（即A1B2C3）进行三批验证实验，结果见表4。由表4可知，验证实验的结果与正交试验优选的结果相符，提示正交试验优选出的工艺条件合理，方法稳定可行。

表4 稳定性试验结果

续断性苦味辛，微温，有补肝肾作用[12]329，续断皂苷是其有效成分之一，含量指标川续断皂苷Ⅵ有成熟的高效液相色谱测定方法，《中国药典》2015年版及相关文献都有收载[14-15]，所以本试验以川续断皂苷Ⅵ的提取率和总固体物收率作为考察指标，在操作应用上是切实可行的。

本提取工艺条件在实际工作中经中试放大验证，结果与小试基本一致，所以该提取工艺条件优选出的条件是合理可行的，可在大生产中应用。

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Research on optimizing the extraction technique of Shanqibushenxiaoke Pills using orthogonal experiments

CHEN Zhen-yao1LIU Yan2▲
1.Drug Manufacturing Room,Hospital of Traditional Chinese Medicine of Zhaoqing City in Guangdong Province,Zhaoqing 526020,China;2.Department of Pharmacy,Zhaoqing Medical College,Guangdong,Zhaoqing 526020,China

[Abstract]ObjectiveTo optimize the extraction technique of Shanqibushenxiaoke Pills.MethodsOrthogonal experimental design was used to optimize the extraction technique.The extraction rate of the Dipsacus saponinⅥand the recovery rate of total solids were used as observation indexes.To determine a more reasonable extraction technique,three factors which had greater influence on the extraction,including the amount of water used,the number of repetitions of extraction,and the extraction time were studied.According to the results of the orthogonal experiments,three pilot scale trials were performed to verify the feasibility of the extraction technique and the consistency of the product quality.Results The experimental result proved that the optimized extraction technique determined by using the orthogonal experiments was as follows:the Chinese herbal pieces was decocted with water and extracted for 2 times,each time with 8 times of water,extracted 2 hours in the first times,extracted 1.5 hours in the second times.ConclusionThe optimized extraction technique for the Shanqibushenxiaoke Pills was feasible and which was suitable for the large scale production.

[Key words]Shanqibushenxiaoke Pills;Extraction technique;Orthogonal experiment;Dipsacus saponinⅥ;The recovery rate of total solid

[中图分类号]R927

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2016）12（b）-0015-04

（收稿日期：2016-11-04 本文编辑：祁海文）

[作者简介]陈震尧（1965-），女，副主任药师，研究方向：医院制剂与质量标准

▲通讯作者：刘燕，主任药师，教授，研究方向：药物质量控制的研究