邱 旻1陈 清1柯雪梅2▲

1.南方医科大学公共卫生学院，广东广州 510515；2.厦门市疾病预防控制中心，福建厦门 361021

[摘要]拟钉螺亚科内物种是多种并殖吸虫及亚洲组血吸虫的中间宿主，对其进行准确的分类鉴定对防控相关寄生虫病有重要作用。然而受限于个体小、形态特征不明显等问题，传统方法难以对拟钉螺亚科内物种作出准确的鉴定。随着近年分子生物学及生物信息学相关技术的高速发展，基因鉴定法变得日趋成熟，这使得快速、准确的鉴定拟钉螺亚科物种成为了可能。本文回顾了近年来基因鉴定法中常用的基因片段及其在拟钉螺亚科分类鉴定方面的应用情况，讨论了目前应用中存在的问题并提出了未来进一步的研究方向。

[关键词]拟钉螺亚科；物种鉴定；基因鉴定；寄生虫病

拟钉螺亚科（Triculinae）隶属于腹足纲（Gastropoda）前鳃亚纲（Prosobranch）圆口螺科（Pomatiopsidae），主要分布于东南亚和中国南部[1]。目前该亚科内的物种已达120种[2]，我国目前发现的拟钉螺亚科物种已有近50种之多，其中绝大多数属于拟钉螺属，主要分布在长江流域地区及其以南的地区。在所有拟钉螺物种中，拟钉螺属（Tricula）、γ拟钉螺属（Gammatricula）以及新拟钉螺属（Neotricula）因可做为多种并殖吸虫[3-7]和（或）亚洲组血吸虫[8-10]的中间宿主而备受研究者关注。然而，拟钉螺作为一种个体微小的淡水螺，很难依据其外壳及唇舌等形态学特征对其作出较为准确的分类，为传染病防控工作者对相关的寄生虫病的宿主监测及防控工作带来了巨大的困难。

近20年来，分子生物学技术和生物信息学技术得到了长足的发展，获得生物体的遗传物质并测定基因序列，进而对序列进行比较分析变得越来越简便易行，这为从分子水平研究物种的分类提供了充分的技术可能[11]。因此，结合了两者的分子系统发生学得到了高速的发展，越来越多的学者开始使用系统发生学的研究方法检验分类学假说并获得更可靠的分类结果[12-15]。而由此诞生的庞大生物遗传信息数据库，又为物种的快速鉴定提供了可能。本文拟对相关技术在拟钉螺亚科物种鉴定上的应用情况作一综述，希望通过总结目前相关技术的应用情况发现目前存在的问题以理清当前的工作要点，更好地将技术应用于实践。

1.1 COⅠ基因

COⅠ基因全称Cytochrome C oxidase subunitⅠgene，其位于生物线粒体基因组上，是编码细胞色素C氧化酶亚单位1的基因。与核基因组比较，其具有高拷贝，进化速率较快、群体内变异大、无组织特异性等特点[16]。COⅠ基因并不是最早被应用于分子鉴定的基因，但其在各种动物鉴定中应用己相当广泛。加拿大奎尔夫大学的Hebert等[17]最早于2003年提出了DNA条码（DNA Barcode）的概念，其认为在数据库完备的情况下，基于COI基因的比对分析可快速准确地鉴定出DNA来源的物种，因此COI可以作为理想的动物DNA条码应用于实际的动物物种鉴定工作中。在其后的几年中，各国学者对COI基因鉴定动物物种的可能性进行了进一步的研究[18-20]，并成立了国际生物条码计划（the internnational barcode of life project，i-BOL）、生物条码协会 （the consortium for barcode of life，CBOL）以及生物条码数据库 （barcode of life database，BOLD）。目前，BOLD中已经收集了包括动物、植物、真菌以及单细胞生物中共计260 135个物种的DNA条码[21]，其收录内容已不限于初创时的COI基因，亦涵盖其他常见的鉴定用基因，适应不同种类物种的鉴定需求。同时，该数据库还同时收录标准的PCR扩增引物，以供研究者参考选用。

1.2 CytB基因

与COI基因类似，CytB基因亦为位于生物线粒体基因组上的基因，其全称为Cytochrome B gene，编码有氧呼吸环中不可缺少的细胞色素B。同样，CytB基因也被广泛应用于各种各样的动物分类鉴定中，并且时常被用来与COI基因鉴定的结果作出比较或者同时使用两种基因进行联合鉴定[22-25]。目前，可在BOLD及GenBank上查询到各种物种的CytB信息。

1.3 rRNA基因

rRNA基因又称rDNA，是一系列种普遍存在于各种细胞内的基因，功能为编码rRNA。rRNA是核糖体的重要构成成分，其根据核糖体大小亚基的分别及真核、原核的差异可分为很多种，也就对应有多种rRNA基因。其中最常被用作鉴定是构成核糖体小亚基的18s rRNA基因（位于核基因组）及16s rRNA基因（位于线粒体基因组及细菌基因组）。构成大亚基的28s及23s虽也有使用，但并不如小亚基（18s/16s）多。rRNA基因具有多个高变及保守的区域，保守区在不同的物种间高度保守，而高变区在不同的物种间则存在显著差异，因此rRNA基因可为分类鉴定提供丰富的信息[26-27]。这些基因除被广泛用于动物植物的分类鉴定外，还常用于各种微生物的研究。数据库方面，除可在Genbank及BLOD上获取相关数据外，还有专门收集微生物数据库rRNA基因的数据库可供查询。如专门收录细菌rRNA基因数据的Greengenes[28]数据库与RDP（Ribosomal Database Project）数据库[29]。这些数据库不仅可以提供相关的数据的比对结果，还可直接在线进行rRNA序列的系统进化分析。

1.4 ITS序列

ITS全称Internal Transcribed Spacer，即内转录间隔区。该区域位于rRNA基因内编码大小亚基的区域之间，是rRNA前体转变为rRNA时被剪切掉的部分，故ITS实际上是完整rRNA基因的一部分[30]。在真核生物中，ITS被5.8s rRNA基因分割为ITS1及ITS2两段，而在原核生物钟ITS仅有一段。该区域的特点是拷贝数高，变异较大，在实际的使用过程中可与前述的18s/16s rRNA基因一同使用，即先分析18s/16s rRNA基因进行初步判定，再通过分析ITS细分到种或者亚种。与rRNA基因类似，除GenBank及BOLD这种通用数据库外，还有一些专门收录ITS序列的数据库，如UNITE[31]这种专门收录真菌ITS序列的数据库。

1.5 其他基因

除上述使用简便且广泛、通用性较高的几种DNA鉴定标记外，亦存在其他的鉴定标记。如在进行细菌分类鉴定时使用的管家基因序列[32]；对植物进行分类时可能会使用的位于叶绿体上的RbCL基因 （RuBis-CO large subunit gene，1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亚基基因）[33]等。这些基因数据均可从Genbank或相关的专门数据库获取。

早在DNA条码提出之前的1994年，Davis等[34]就开始采用COI基因作为标记，尝试结合解剖学及DNA信息以对圆口螺科内几种重要物种进行更精确的分类。其采集选取了圆口螺科中钉螺亚科和拟钉螺亚科下的部分属的物种（包钉螺、新拟钉螺及γ拟钉螺），观察标本的形态学及解剖学特征，比使用PCR的手法从螺体DNA中扩增出长度为598 bp的片段用于系统进化分析。这项结果显示，圆口螺科下的不同亚科内的物种在解剖学特征上有明显的差异，并且对COI基因进行的系统进化分析结果支持差异的存在，故认为圆口螺科下的亚科分类是可靠的。

Attwood等[35]在2004年使用16s rRNA及28s rRNA基因序列对圆口螺科内的9个物种（多数为拟钉螺属下物种）进行了比较与研究。结果显示，使用不同的系统进化分析方法分别对16s rRNA基因数据及18s rRNA基因数据进行分析可得到一致的结果，但16s rRNA基因与18s rRNA基因的结果间存在明显的差异，研究者认为这可能是湄公河流域周围的环境不太稳定，地区内存在长期且快速的种群交换，使同一种群内不同个体间存在着较大的差异。

关飞等[36]于2007~2009年从我国各地采集了12株不同的拟钉螺亚科样本，在经过初步的形态学鉴定后，从样本中提取总DNA，进而扩增样本的COI基因、16s rRNA基因、28s rRNA基因以及ITS1区域并进行测序与分析。其研究结果显示，COI、16s、28s中，COI变异性最大而28s最保守，三种基因分别适用于低阶、中阶以及高阶的遗传多样性分析。同时，研究还验证了引入其二级结构特征可以使ITS1序列分析结果更为可靠的观点。另外，在结合形态学信息以及基因分析的结果进行综合分析后，研究还发现采自湖北沈家堡的齿拟钉螺与小口拟钉螺应分别为秉氏和向氏拟钉螺，而这两种拟钉螺在基因序列上高度相似（达99%），应考虑为同一物种下的不同地域株。

Liu等[2]在2014年开展了一项基于COI及rrnL两个基因片段的研究，研究中参照圆口螺科分布的生态地理特点，尽可能地获取了各种圆口螺科内物种的基因序列以进行系统进化分析。分析结果显示拟钉螺属与新拟钉螺属不为并系进化，同时推测越南背部的拟钉螺亚科物种很可能来源于我国云南或福建的γ拟钉螺。

与传染血吸虫的钉螺类似，拟钉螺亚科的分类鉴定的研究经历了一个相当漫长的过程，从最初的形态学到种群遗传学再到今天的分子生物学及生物信息学，在新的研究方法的帮助下，拟钉螺亚科内物种间的关系有望变得越来越清晰。但是从目前的情况来看，仍有许多问题亟待解决。

作为一种相对成熟的物种分类鉴定研究手段，基因鉴定技术已被广泛的应用于各个学科的多种方面，然而在拟钉螺亚科的研究中，相关的报道还明显非常少。即使与同样研究不算充分的钉螺相比较，拟钉螺亚科的相关研究明显更不充分，仅处于刚刚起步的阶段。其次，目前已见诸报道的研究较为简单，多数仅选择了1~2个基因进行研究，样本的来源范围以及样本的代表性都有待进一步提升。目前，被报道过的拟钉螺亚科物种虽多达120种，但在NCBITaxonomy数据库中记录在案的仅有47种，这些物种中，大多数仅收录了10条以内的参考序列，可用数据可谓相当匮乏。而基于测序的基因鉴定方法的准确性又在很大程度上依赖于参考数据库的准确以及完备[37]。因此，相关数据库仍亟待完善。

基于基因测序的基因鉴定法已在许多研究领域成为了重要的分类鉴定研究方法，可以预见，随着拟钉螺亚科相关研究的进一步开展以及相关资料的逐渐完善，这种方法必将在拟钉螺的研究及防控工作中发挥更加重要的作用。

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Application progress of gene identification technology in species identification of Triculinae

QIU Min1CHEN Qing1KE Xue-mei2▲
1.Department of Public Health,Southern Medical University in Guangdong Province,Guangzhou 510515,China;2.Xiamen Center for Disease Control and Prevention in Fujian Province,Xiamen 361021,China

[Abstract]Triculinae is known to be the intermediate host of Paragonimus and Asian Schistosomes,and the accuracy of identification result of Triculinae is essential for the control of parasitic diseases caused by Paragonimus and Asian Schistosomes.Due to its small size and lack of significant appearance feature,it′s hard to identify Triculinae accurately. With the development ofmolecular biology and bioinformatics,it is possible to identify Triculinae species using genetic method now.This paper reviews gene segements frequenctly used in species identification and their application to Triculinae identification,and discusses the obstacle for further use.

[Key words]Triculinae;Species identification;Geneticmethod;Parasitic diseases

[中图分类号]R383.2

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2016）12（a）-0011-04

（收稿日期：2016-11-07本文编辑：任 念）

[基金项目]福建省科技厅科技项目（2011D015）