刘京 于田田 陈玉华 李敬达 陶娅妮 李明英 王晓 陈勇 迟彦▲

大连大学生命科学与技术学院糖脂代谢重点实验室，辽宁大连116622

[摘要]目的构建血凝素样氧化低密度脂蛋白受体-1（LOX-1）真核表达载体，筛选高表达菌株，为体外获得有活性重组蛋白奠定基础。方法以实验室保存的含有人源LOX-1基因的质粒为模板PCR扩增LOX-1基因，经过TA克隆后亚克隆至酵母表达载体pPICZαA，将获得的重组质粒电转化至毕赤酵母X-33，利用原位双膜法快速检测阳性高表达菌株，最后经过甲醇诱导，采用Western blot检测LOX-1的表达。结果成功构建LOX-1真核表达载体，双膜法筛选到高表达菌株；Western blot结果显示，LOX-1在上清中得到表达。结论LOX-1基因在毕赤酵母细胞上清中得到表达，为体外获得活性重组蛋白和研究其致动脉粥样硬化功能奠定基础。

[关键词]血凝素样氧化低密度脂蛋白受体-1；真核表达载体构建；毕赤酵母；动脉粥样硬化

血凝素样氧化低密度脂蛋白受体-1（lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1，LOX-1）属于E类清道夫家族成员，是C型植物凝集素样Ⅱ型跨膜蛋白，由273个氨基酸组成[1]。在结构上由1个短的N端细胞质区，单链跨膜区，细胞外区域和1个C端血凝素样配基连接区4个部分组成[2]。近年来发现LOX-1参与动脉粥样硬化形成的所有阶段，在内皮细胞、巨噬细胞、血管平滑肌细胞、血小板上都有表达[3-6]。通常情况下，LOX-1的表达量很低，但是炎性反应、促氧化性和机械刺激能够上调其表达[7-8]，高血压、糖尿病、高血脂、慢性肾功能衰竭等患者LOX-1的表达量也显著上调[9-10]。LOX-1是氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，oxLDL）的关键受体，在动脉粥样硬化的发病过程中，oxLDL与LOX-1蛋白结合从而进入巨噬细胞，引起泡沫细胞堆积在血管内壁上，是动脉粥样硬化病变的一个关键因素[11-12]，因此，LOX-1在动脉粥样硬化的病变中有着重要的作用。本研究克隆了LOX-1的编码区基因序列，构建

其真核表达载体，在毕赤酵母中成功表达了LOX-1重组蛋白，为进一步体外研究其致动脉粥样硬化的病理作用奠定了基础。

1.1 材料

E.coli DH5α克隆表达菌为本实验室保存；Pichia X-33真核菌株、pPICZαA真核表达载体购自Invitrogen；pMD 19-TSimple Vector、LA Taq酶、DNA连接试剂盒、限制性内切酶XbaⅠ、XhoⅠ、SacⅠ、DNA Marker DL 2000、DNA Marker DL 5000均购自TaKaRa；DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒、尼龙膜、醋酸纤维素薄膜、抗生素Zeocin、Amp、胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂以及甲醇等常用试剂均购自上海生物工程有限公司；ECL试剂盒购自上海碧云天生物工程有限公司；镍琼脂糖凝胶购自北京韦氏博慧色谱科技有限公司；抗-His抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG购自北京中杉金乔生物公司；引物由上海生物工程有限公司合成，DNA测序由上海生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 LOX-1基因的扩增与TA克隆根据GeneBank中LOX-1序列比对，以软件Primer 5.0设计扩增引物。LOX-1引物设计，上游引物：5′-CCGCTCGAGAAAAGAATGACTTTTGATGACCTAAAGATC-3′；下游引物：5′-GCTCTAGATTATCAATGATGATGATGATGATGGG AACCACCACCACCCTGTGCTCTTAGGTTTGC-3′。上游引物中5′端含有保护碱基、XhoⅠ酶切位点（单划线）、信号肽识别位点（斜体）以及LOX-1 5′端部分氨基酸编码基因序列；下游引物中5′端含有保护碱基、XbaⅠ酶切位点（单划线）、终止密码子、6个His（字符边框），GGGGS柔性肽（斜体）以及LOX-1 3′端部分氨基酸编码基因的互补序列以及终止密码子。以实验室保存的人源LOX-1 T载体为模板，以LOX-1引物进行PCR，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30个循环；72℃终延伸7min。取PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收后将目的基因连接至pMD19-T载体，转化E.coli DH5α感受态菌，挑取阳性克隆提取质粒，送至上海生物工程有限公司测序，测序结果与GenBank中的人LOX-1序列比对，将测序正确的重组质粒命名为pMD19-T-LOX-1。

1.2.2 真核表达载体的构建与鉴定提取重组质粒pMD19-T-LOX-1和pPICZαA载体质粒，分别用XbaⅠ、XhoⅠ进行双酶切。回收酶切产物LOX-1片段和pPICZαA大片段，16℃连接1 h后在含有Zeocin（25 μg/ml）抗性培养基上进行转化和扩大培养，提取质粒，进行XbaⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定。

1.2.3 原位双膜法快速筛选LOX-1高表达酵母菌株使用SacⅠ内切酶对表达载体进行单酶切，回收酶切产物。将酶切产物电转化入毕赤酵母X-33工程菌中，涂布到100μg/ml Zeocin抗性YPDS平板上，30℃培养至菌落肉眼可见。在BMMY板上置一同样大小的NC膜，并将菌落点于NC膜上，30℃孵育96 h。期间在盖子上补加甲醇和水。将PVDF膜置于NC膜上，用涂布棒轻压使PVDF膜完全湿润并赶尽气泡，使所有菌落转移到PVDF膜上。取下PVDF膜，并进行蛋白印迹杂交显色。Quantity One软件分析免疫印迹显色的强弱，鉴定转化子表达水平的高低。

1.2.4 Wes te rn b l ot方法检测目的蛋白的表达情况将初筛效果好的菌株接种到10 ml BMGY中。30℃，200 r/min摇瓶培养24 h。4℃，1500 r/min离心菌液5 min，丢掉上清。加入含有100 ml含有1％甲醇的BMMY培养基诱导表达。每天补加1％甲醇，共诱96 h，每隔24 h收集上清。取不同时间段（甲醇诱导前，诱导24、48、72及96 h）收集的蛋白上清进行12％SDS-PAGE电泳，电泳后将蛋白转移到PVDF膜上，5％脱脂奶粉封闭1 h，抗-his抗体4℃孵育过夜，含2.5％脱脂奶粉的TBST洗膜2次。HRP标记山羊抗鼠的二抗室温缓慢孵育1 h，清洗同上。ECL显色，化学发光仪观察，凝胶成像系统下分析结果。

2.1 LOX-1基因的扩增与表达载体构建

LOX-1基因的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，条带大小810 bp，与预期一致（图1A）。将按照上述方法构建的重组质粒进行XbaⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定，经琼脂糖凝胶电泳分析，酶切出810 bp的LOX-1基因片段，表明LOX-1基因连接至表达载体pPICZαA上（图1B），获得重组质粒pPICZαA-LOX-1。

 

图1 LOX-1基因PCR扩增及表达载体酶切鉴定

2.2 原位双膜法快速筛选LOX-1高表达酵母菌株

提取重组质粒pPICZαA-LOX-1，经SacⅠ酶切后，琼脂糖凝胶电泳结果显示分析为一条带，表明表达载体线性化酶切完全（图2A）。将酶切产物回收后电转化至毕赤酵母感受态细胞，采用原位双膜法筛选高表达菌株，结果如图2B所示，PVDF膜上出现强弱不等的杂交信号。用Quantity One软件分析菌落光密度，光密度越强表明转化子表达量越高。

 

图2 表达载体单酶切及双膜法检测

2.3 W estern blot方法检测目的蛋白的表达情况

将筛选得到的阳性转化子进行甲醇诱导表达，并分别于甲醇诱导前，诱导24、48、72及96 h离心收集发酵液上清，取少量上清液进行Western blot分析，结果如图3所示，随着诱导时间增加，杂交信号也在逐渐增强，诱导96 h表达量最高。杂交信号条带大小在30 kDa左右，与预期一致。说明P.rLOX-1重组蛋白在毕赤酵母X-33中成功表达。

 

图3 Western blot方法鉴定LOX-1重组蛋白在毕赤酵母X-33中的表达

LOX-1是近年来新发现的细胞表面主要的oxLDL受体，研究发现该受体特异性地结合并摄取oxLDL，介导由oxLDL诱导的一系列病理变化，如巨噬泡沫细胞的形成、内皮细胞活化和紊乱的产生、平滑肌细胞的迁徙和增生等[13-14]。其中，LOX-1识别并内吞oxLDL进而导致单核巨噬细胞转变为泡沫细胞，是动脉粥样硬化及继发血栓疾病的关键事件[15-16]。除了oxLDL，LOX-1也可以与凋亡及衰老的细胞、中性粒细胞等连接，LOX-1还可以作为炎症细胞的粘连分子[17]，参与到促进动脉粥样硬化形成的不同阶段。因此研究LOX-1与其配体的相互作用及以其为靶点，建立抑制LOX-1与配体结合，进而阻断下游一系列的病理过程的治疗策略显得尤为重要[18]。毕赤酵母表达系统是近年来建立起来的一种真核表达系统，它既具有原核表达系统繁殖快、操作简单的优点，同时又能对表达的目的蛋白进行正确加工、折叠及适度糖基化，因此被广泛地应用于重组蛋白的表达和功能研究。

为了体外获得有活性的重组LOX-1、体外研究LOX-1与配体结合的分子机制、建立抑制LOX-1与配体结合的治疗策略，本研究首次构建了人源LOX-1基因的酵母表达载体，并利用电转化方法导入毕赤酵母X-33细胞中，利用双膜法筛选到高表达的菌株，最后利用甲醇发酵在上清中获得重组LOX-1的表达，为今后以其为靶点治疗动脉粥样硬化奠定基础。

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Study of the establishment of human LOX-1 gene Pichia expression vector and its expression

LIU Jing YU Tian-tian CHEN Yu-hua LI Jing-da TAO Ya-ni LIMing-ying WANG Xiao CHEN Yong CHIYan▲
Key Laboratory of Carbohydrate and Lipid Metabolism Research,College of Life Science and Technology,Dalian University,Liaoning Province,Dalian 116622,China

[Abstract]Objective To construct LOX-1 eukaryotic expression vector and screen high expression strain,lay the foundation for obtaining active recombinant LOX-1 protein in vitro.M ethods LOX-1 gene was amplified by PCR with the plasmid containing human LOX-1 gene as a template.After TA clone,LOX-1 gene was subcloned into eukaryotic expression vector pPICZαA to obtain pPICZαA-LOX-1 recombinant plasmid.After double digestion identification,the positive recombinant plasmid was electro transformed into Pichia pastoris X-33.Situ double membrane hybridization method was used to rapidly screen positive highly expressed strains.Finally,Western blotwas used to test its expression. Results LOX-1 recombinant expressed vector was constructed and highly expressed strain was screened out successfully.Western blot results showed that the LOX-1 recombinant protein was expressed in the cell culture supernatant after induction by methanol.Conclusion LOX-1 gene is expressed in Pichia pastoris cell supernatant.This study laies a foundation for obtaining active recombinant LOX-1 protein in vitro and studying its role in atherosclerosis.

[Key words]LOX-1;Vector construction;Pichia pastoris;Atherosclerosis

[中图分类号]R363

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2016）11（b）-0004-04

（收稿日期：2016-08-10本文编辑：任念）

[基金项目]国家自然科学基金资助项目（81202536）；辽宁省大学生创新训练项目（201511258040）

[作者简介]刘京（1994-），女，辽宁锦州人，大连大学生命科学与技术学院2013级生物工程专业本科在读

▲通讯作者：迟彦（1974-），女，辽宁大连人，博士，副教授，研究方向：糖脂代谢