肺癌m dig基因对组蛋白H 3及H 4部分位点赖氨酸残基甲基化状态的作用
李智佳 章海波 杨 柳 颜艳飞
广东药学院附属第一医院胸心外科，广州 510080
广东药学院附属第一医院胸心外科，广州 510080
［摘要］目的 研究肺癌mdig基因对组蛋白H3及H4部分位点赖氨酸残基甲基化状态的作用，为肺癌的诊断和治疗建立基础。方法随机选择2010年12月～2015年12月我院收治的肺癌患者200例（病例阶段为T1～T4期）作为本次研究的对象，对患者癌组织和癌旁组织中UTX与Rb的mRNA和蛋白质含量进行检测，同时检测肺癌及癌旁组织中H3K27me3和Rb蛋白含量以及UTX去甲基化酶活性，以确定UTX表达及功能异常在肺癌发生、发展和预后中的作用。结果 肺癌患者不同病理期的癌组织和癌旁组织中UTX与Rb的mRNA和蛋白质含量不同，肺癌患者肺癌组织及癌旁组织中H3K27me3和Rb蛋白含量以及UTX去甲基化酶活性差异有统计学意义 （P＜0.05），对肺癌mdig基因肺癌细胞中的H3K27me3含量进行检验，沉默mdig肺癌细胞、过表达mdig肺癌细胞中H3K27me3含量无明显变化（P＞0.05）。结论 组蛋白去甲基化酶、UTX、Rb，在肺癌组织的发生和发展中发挥着重要的作用，其可以抑制肿瘤细胞的发展，控制癌细胞的扩散，加强对组蛋白H3及H4部分位点赖氨酸残基甲基化状态的检测和研究，对肺癌的治疗和诊断有重要的意义。
［关键词］肺癌；组蛋白去甲基化酶；UTX；RB
肺癌是临床治疗中发病率较高的恶性肿瘤，有较高的死亡率，对患者的生命安全和身体健康产生着较大的威胁［1］。近几年肺癌的发病率呈现升高趋势，已经成为当前严重影响人类健康的恶性肿瘤疾病之一。肺癌是当前发病率较高的恶性肿瘤疾病，但是医学研究中对肺癌发病的机制研究尚不明确，所以在肺癌的临床治疗中，还存在一定的局限性。近几年有相关研究表明组蛋白甲基化在肺癌的发生和发展中起着关键性的作用，对组蛋白甲基化等相关的内容进行研究，可以为癌症的治疗和诊断提供临床依据。为此本文针对肺癌mdig基因对组蛋白H3及H4部分位点赖氨酸残基甲基化状态的作用进行研究。
1 资料与方法
1.1 一般资料
随机选择2010年12月～2015年12月我院收治的肺癌患者200例（病例阶段为T1～T4期）作为本次研究的对象，均经病理确诊。肺癌患者T1期50例，T2期50例，T3期50例，T4期50例。患者年龄为42～76岁，平均年龄为（64.5±2.3）岁。所有患者对本次研究均知情，且自愿参与本次研究。
1.2 方法
患者癌组织和癌旁组织进行总RNA和总蛋白的提取，然后分别用定量PCR和Western blot技术检测UTX和Rb的mRNA和蛋白表达变化。用Western blot技术和H3K27me3试剂盒检测H3K27me3的含量变化。免疫组化分析癌组织和癌旁组织中UTX、Rb 和H3K27me3含量差异，同时检测肺癌及癌旁组织中H3K27me3和Rb蛋白含量以及UTX去甲基化酶活性。其中Western blot技术检测使用RIPA液裂解细胞，超声、离心、提取，测定蛋白质浓度，按照同样的体积，等质量配制样本，95℃加热5min，配制15%胶，上样，130 V，90min，电泳、转膜、洗膜、封闭，抗孵育，获取X线胶片显影。
1.3 观察指标
观察免疫蛋白印迹学检验结果、UTX与Rb的mRNA和蛋白质含量。
1.4 统计学方法
采用统计软件SPSS 16.0对实验数据进行分析，计量资料以均数±标准差（
±s）表示，采用t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
±s）表示，采用t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。2 结果
2.1 肺癌mdig基因稳定转染细胞体系的建立
红色荧光采用肺癌沉默mdig质粒转染A549细胞表达，绿色荧光采用肺癌过表达mdig质粒转染A549细胞表达（图1、图2）。
.jpg)
图1 沉默m dig肺癌细胞（×200）
.jpg)
图2 过表达mdig肺癌细胞（×200）
2.2 免疫蛋白印迹检验结果的分析
针对本次研究中肺癌mdig基因肺癌细胞中的H3K27me3含量进行检验，沉默mdig肺癌细胞中H3k9me3表达明显减少，而shRNA沉默mdig肺癌细胞中的H3k9me3表达则明显增加，另过表达mdig肺癌细胞中H3K27me3、H3k9me1、H3k9me2、H3k4me3等含量无明显变化（P＞0.05）（图3、图4）。
.jpg)
图3 过表达中的H3K27me3含量
.jpg){kind=small}
图4 沉默表达中的H3K27m e3含量
2.3 不同病理患者不同组织中UTX与RbmRNA和蛋白质含量的比较
肺癌患者不同病理期，癌细胞、癌旁组织中的UTX与Rb的mRNA和蛋白质含量不同，T1期患者癌细胞中的UTX与Rb的mRNA和蛋白质含量高于癌旁组织，其中Rb组织中的蛋白表达均明显呈增加趋势，且高于其他期患者癌细胞中的含量（P＜0.05）。T4期肺癌患者癌细胞中的UTX与Rb的mRNA和蛋白质含量明显少于癌旁组织以及其他期患者的UTX 与Rb的mRNA和蛋白质含量（P＜0.05）。
3 讨论
在临床治疗中，肺癌是常见的恶性肿瘤疾病，其对人类的身体健康和生命安全有较大的威胁［2］。近几年，恶性肿瘤疾病的发病率不断升高，肺癌已经成为严重影响人类生命安全的恶性肿瘤疾病之一，其死亡率较高。目前在肺癌的临床治疗中，对其发病的机制尚不明确，所以在治疗中还存在一定的局限性［3］。
在肺癌患者的治疗中，肿瘤组织的发生、发展，受到一定组织作用的影响。相关的研究表明，组蛋白甲基化在肺癌发生、发展中发挥重要作用，组蛋白去甲基化酶UTX突变与肺癌发生密切相关，UTX可催化H3K27me3去甲基化，影响去甲基化酶活性，参与细胞分化、增殖，将野生型UTX导入UTX失活的癌细胞内可减少癌细胞增殖，当肺癌发生体细胞UTX突变时，致细胞去甲基化酶活性丧失，H3K27me3含量增多，促进细胞分化、增殖。Rb能抑制过量细胞增殖，当UTX与Rb基因启动子结合，催化H3K27me3去甲基化可增加Rb基因表达，减少细胞增殖［4-5］。UTX突变细胞增殖增加时，表现出肿瘤样生长特征。
在肺癌患者疾病发展的过程中，组蛋白甲基化发挥着重要的作用，而组蛋白甲基化的状态与基因的表达有较大的关系，肿瘤细胞自身也存在组蛋白甲基化异常，对肿瘤细胞的组蛋白甲基化状态进行检验，则对肿瘤的诊断、预后、治疗有较大的帮助［6］。
本文针对肺癌mdig基因对组蛋白H3及H4部分位点赖氨酸残基甲基化状态的作用等内容进行了研究，结果肺癌患者不同病理期的癌组织和癌旁组织中UTX与Rb的mRNA和蛋白质含量不同，肺癌患者肺癌组织及癌旁组织中H3K27me3和Rb蛋白含量以及UTX去甲基化酶活性差异显著，对肺癌mdig基因肺癌细胞中的H3K27me3含量进行检验，沉默mdig肺癌细胞、过表达mdig肺癌细胞中H3K27me3含量无明显变化。H3K27me3可以促进异常染色发生，使得沉默基因活化，而组蛋白甲基化则是通过组蛋白甲基转移酶以及组蛋白去甲基化酶实现的［7-8］。前期试验提示肺癌组织中UTX表达量高于癌旁组织，本项目以组蛋白去甲基化酶UTX作为主要指标，对肺癌患者的癌与癌旁组织UTX和RB基因表达、UTX酶活性与H3K27me3含量行检测，确定UTX对肺癌抑制作用。
本研究借助肺癌临床标本和细胞实验确定组蛋白去甲基化酶UTX在肺癌发生中的作用，利用UTX 和RB基因表达及UTX酶活性与H3K27me3含量进行检测，分析其在各不同病理类型肺癌中的差异，将有可能为肺癌早期诊断和生物治疗提供思路，为肺癌的诊断和治疗提供潜在靶点［9］。在肺癌癌细胞系中利用RNAi建立人UTX的RNA干扰肺癌细胞系，体外观察细胞增殖的变化，同时检测Rb的mRNA和蛋白表达，以确定UTX介导的Rb下调在肺癌增殖中的作用。利用RNAi技术降低癌细胞系中的UTX和Rb表达量国内外报道尚少。本课题完成将加深对肺癌发生机制的理解，也将对肺癌的早期诊断和中晚期治疗提供重要切入点。
结合临床标本和细胞实验确定UTX在非小细胞肺癌发生和发展中的作用，从而开发出能应用于肺癌早期诊断的试剂盒奠定基础，并就其敏感性和有效性进行初步探索，以确定其应用价值［10-12］。本文针对肺癌mdig基因对组蛋白H3及H4部分位点赖氨酸残基甲基化状态的作用进行研究，文章中涉及到的知识还无法确定组蛋白H3及H4部分位点赖氨酸残基甲基化状态，对肺癌mdig基因的抑制等作用，需要对研究内容进一步的深入研究，建立人UTX的RNA干扰肺癌细胞系，体外观察细胞增殖的变化，同时检测Rb的mRNA和蛋白表达，以确定UTX介导的Rb下调在肺癌增殖中的作用，通过进一步的深入研究，确定UTX表达减少对H3K27me3含量和Rb蛋白表达的影响［13-14］，进而为肺癌的治疗、诊断提供研究资料。本次研究中还存在一定的不足，还需要进一步加强试验证明结论的真实性和可行性，为肺癌诊断试剂盒的开发，提供依据基础。
［参考文献］
［1］赵俊龙，秦鸿雁，韩骅，等.组蛋白甲基转移酶的研究进展［J］.国际遗传学杂志，2011，34（3）：141-147.
［2］郑一超，马金莲，王志茹，等.抗肿瘤药物新靶点：表观遗传组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1［J］.国际药学研究杂志，2014，41（1）：30-36.
［3］Ogasawara S，Komuta M，Nakashima O，et al.Accelerated expression of a Myc target gene Mina53 in aggressive hepatocellular carcinoma［J］.Off J Jpn Soc Hepatol，2010，40 （4）330-336.
［4］潘辉，罗学刚，郭姝，等.组蛋白甲基化及其与肿瘤间的关系［J］.生理科学进展，2010，41（1）：22-26.
［5］HironoriIshizaki，Hirohisa Y，Makoto T，et al.Overexpression of the Myc target gene Mina53 in advanced renal cell carcinoma［J］.Pathol Int，2007，57（10）：672-680.
［6］洪苓苓，马旭东.组蛋白甲基化修饰的研究进展［J］.临床血液学杂志，2010，23（1）：54-56.
［7］Jonathan JL，George FM，ChristineGL.Melanomaepigenetics：novelMechanisms，markers，andmedicines［J］.Lab Invest，2014，94（8）：822-838.
［8］于淼淼，赵洪文.肺癌mdig基因对H3k9me3的去甲基化作用［J］.现代肿瘤医学，2015，23（10）：1328-1332
［9］叶覃，Andreana H，Roselyne ML，等.组蛋白去甲基化酶家族中组蛋白去甲基化酶4作用机制及其应用的研究进展［J］.转化医学杂志，2014，3（1）：13-18.
［10］Fukahori S，Yano H，Tsuneoka M，et al.Immunoh istochemicalexpressionsof Cap43 and Mina53 proteins in neuroblastoma［J］.JPediat Surg，2007，42（11）：1831-1840.
［11］郭艺迪，梁冬雪，李悦，等.赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1与白血病的研究进展［J］.生物技术通讯，2014，25 （2）：252-258.
［12］郭雪，刘意，杨慧蓉，等.组蛋白去甲基化酶JARID1B的表达纯化及酶活力分析［J］.复旦学报（医学版），2012，39 （4）：342-347.
［13］Zhang Y，Lu Y，Yuan BZ，et al.The human mineral dustinduced gene，mdig，is a cell growth regulating gene associatedwith lung cancer［J］.Oncogene，2005，31（31）：4873-4882.
［14］Zhang Q，Hu CM，Yuan YS，et al.Expression of Mina53 and its significance in gastric carcinoma［J］.Int J Biol Marker，2008，2（2）：83-88.
Effect of lung cancer m dig gene on methylation status of lysine residues on histone H 3 and H 4 partial loci
LIZhi-jia ZHANG Hai-bo YANG Liu YAN Yan-fei
Department of Cardiothoracic Surgery，the First Hospital Affiliated to Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510080，China
Department of Cardiothoracic Surgery，the First Hospital Affiliated to Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510080，China
［Abstract］Objective To research the effect of lung cancer mdig gene （mineral dust-induced gene）on methylation status of lysine residues on histone H3 and H4 partial loci，and to provide basis for diagnosis and treatment of lung cancer.M ethods 200 patientswith lung cancer（T1-T4）treated in our hospital from December 2010 to December 2015 were randomly selected，and UTX，Rb mRNA and protein content of cancer tissue and para-carcinoma tissue were detected，as well as the H3K27me3 and Rb protein content，and activity of UTX demethylase of cancer tissue and paracarcinoma tissue，to determine the effect of UTX expression and dysfunction in development，progress，and outcome of lung cancer.Results The UTX and Rb ofmRNA and protein content of cancer tissue and para-carcinoma tissue were various among patientswith lung cancer at different stages，and therewere significant differences in H3K27me3 and RB protein content，and activity of UTX demethylase of cancer tissue and para-carcinoma tissue in lung cancer patients（P＜0.05）.According to the result of H3K27me3 content detection in lung cancermdig gene lung carcinoma cells，there was no significant difference in H3K27me3 content between silentmdig lung carcinoma cells and over-expressedmdig lung carcinoma cells （P＞0.05）.Conclusion Histone demethylase，UTX，and Rb play an important role in development and progress of lung cancer tissues by inhibiting development of cancer cells and controlling spread of cancer cells.More studies on methylation status of lysine residues on histone H3 and H4 partial loci have significantmeanings for treatment and diagnosis of lung cancer.
［Key words］Lung cancer；Histone demethylase；UTX；Rb
［中图分类号］R734.2［文献标识码］A
［文章编号］1674-4721（2016）07（b）-0011-04
［基金项目］广东省科技计划项目（粤科规划2013-137-11）
（收稿日期：2016-03-05本文编辑：卫 轲）