拉米夫定联合干扰素α-2a治疗对乙型肝炎患者PD-1及Toll-4表达的影响
任利霞　孟延红
河南省三门峡市黄河三门峡医院药学部，河南三门峡　472000
［摘要］目的探讨拉米夫定联合干扰素α-2a治疗对乙型肝炎患者程序性死亡受体1（PD-1）及To11受体4（To11-4）表达水平的影响。方法选择2011年1月～2013年12月我院收治的伴有HBV-DNA、HBeAg及DNA多聚酶阳性等病毒复制标志阳性的慢性活动性乙型肝炎患者100例，将其随机分为两组，每组50例。对照组进行拉米夫定抗病毒治疗、提高机体兔疫力、保证营养支持及保肝护肝等处理；观察组在对照组基础上联合应用干扰素α-2a治疗。比较治疗后两组CD8+T细胞的PD-1、To11-4表达水平及乙型肝炎病毒DNA载量和血清丙氨酸氨基转移酶（ALT），比较治疗后两组患者临床症状发生率。 结果观察组CD8+T细胞PD-1及To11-4表达水平均显著低于对照组（P＜0.05）；观察组患者血清乙型肝炎病毒DNA载量及血清ALT均显著低于对照组（P＜0.05）；观察组患者厌食、乏力、恶心呕吐及肝区隐痛的发生率显著低于对照组（P＜0.05）。　结论 干扰素α-2a能显著降低CD8+T细胞PD-1及To11-4的表达水平，提高机体兔疫力，降低乙型肝炎病毒DNA水平，改善患者肝功能。
［关键词］干扰素α-2a；乙型肝炎；程序性死亡受体1；Toll受体4
我国是慢性乙型肝炎的高发国家，统计学调查［1］显示，我国超过10%的人群为乙型肝炎病毒携带者。乙型肝炎给个人、家庭及社会均带来较大的负面影响，因其治疗效果不理想，长期发病易引起肝硬化导致肝癌的发生［2］，故临床上如何更好地治疗慢性乙型肝炎、延缓疾病发展进程，甚至彻底杀灭乙型肝炎病毒，使患者获得乙型肝炎病毒抗体，是多年来科学家们孜孜不倦研究的目标［3］。国内外相关研究［4］提示，应用干扰素α-2a治疗，并根据患者HBeAg血清学转换指标进行观察，至少持续联合抗病毒治疗1年，能显著改善患者肝功能，改善患者临床症状，提高乙肝转阴率［5］；且应用干扰素α-2a治疗乙型肝炎，可诱导患者体内抗病毒基因表达增强，在治疗同时一般不产生直接的肝细胞毒性。本研究从细胞分子角度出发，旨在探讨干扰素α-2a联合拉米夫定治疗慢性乙型肝炎，对其患者CD8+T细胞的程序性死亡受体1（PD-1）及To11受体4（To11-4）表达水平的影响。
1　资料与方法
1.1　一般资料
选择2011年1月～2013年12月我院收治的伴有HBV-DNA、HBeAg及DNA多聚酶阳性等病毒复制标志阳性的慢性活动性乙型肝炎患者100例，所有患者均通过临床表现、血清学诊断确诊，均存在应用干扰素α-2a治疗指征，排除对干扰素α-2a过敏者、合并严重心肺功能障碍及既往1年内应用兔疫制剂治疗者。将其随机分为两组，每组50例。其中观察组应用干扰素α-2a治疗：男33例，女17例，年龄19～55岁，平均（45.1±3.5）岁，乙型肝炎病程1～35年，平均（12.3±3.8）年，治疗前丙氨酸氨基转移酶（a1anine aminotransferase，ALT）水平为50.8～295.5 U/L，平均（125.5±26.9）U/L，治疗前PD-1表达水平为6.1%～10.5%，平均（8.3±2.0）%，To11-4表达水平为3.7～8.8 MFI，平均 （6.8±1.0）MFI，“大三阳”者23例，“小三阳”者27例；对照组未使用干扰素α-2a治疗：男34例，女16例，年龄20～55岁，平均（45.2±3.6）岁，乙型肝炎病程1～34年，平均（12.6±3.9）年，治疗前ALT水平为50.5～300.5 U/L，平均（125.9±26.8）U/L，治疗前PD-1表达水平为6.2%～10.6%，平均（8.2±2.1）%，To11-4表达水平为3.8～8.7 MFI，平均（6.7±1.1）MFI，“大三阳”者24例，“小三阳”者26例。两组患者性别、年龄、病程及乙型肝炎病毒感染类型等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究取得医院伦理委员会批准，根据患者经济情况及个人意愿，在入组前患者均签署知情同意书。
1.2　研究方法
对照组患者应用拉米夫定（葛兰素史克制药，国药准字H20030581）抗病毒治疗，口服，成人0.1 g/次，1次/d，胸腺肽（长春海悦药业有限公司，国药准字H20003046）增加cAMP水平进而增强T细胞活性，10 mg/d，肌内注射，3个月为1个疗程，益肝灵片（上海朝晖药业有限公司，国药准字Z31020107）稳定肝细胞膜，促进肝细胞再生，2片/次，3次/d，3个月为1个疗程，并结合营养支持、维持水电解质平衡、注意休息、保持良好心态等对症处理。观察组在对照组治疗基础上，联合应用干扰素α-2a（海南欣明达生物制药有限公司，国药准字S10970079）皮下注射，5 000 000 IU/次，3次/周。
1.3　观察指标
抗病毒治疗指征：HBV DNA水平＞1×104拷贝/m1和（或）血清ALT水平超过正常值上限，肝活检显示重度至重度活动性炎症、坏死和（或）肝纤维化的乙型肝炎患者都需要进行抗病毒治疗，所有患者均连续治疗1年，比较两组治疗前后CD8+T细胞的PD-1及To11-4表达水平，以及乙型肝炎病毒DNA载量和血清ALT，统计治疗后两组患者临床症状改善情况。
1.4　检测方法
1.4.1　CD8+T细胞PD-1测定 通过流式细胞仪进行检测，首先留取患者新鲜静脉血加入EDTA抗凝，并加入CD8+T细胞表面PD-1及其相应抗体，在4℃避光条件下进行孵育，20 min后加入患者红细胞裂解液500 μ1，再次于4℃避光条件下孵育10 min，之后加入1000 μ1 PBS溶液，500 r/min离心5 min，反复洗涤两次后进行流式细胞仪测定。
1.4.2　Toll-4检测 因To11-4为细胞膜表面标志物，故在获取标本后直接加人TLR4-APC，通过流式细胞仪即可测定To11-4表达水平。
1.4.3　乙型肝炎-DNA载量测定　通过实时荧光定量法进行检测，采用荧光定量PCR试剂盒，严格按照说明书进行操作，其中荧光定量仪使用ABI PRISM 7500型荧光定量PCR仪，最低检出限为500 copies/m1。
1.4.4　血清ALT测定　采用7600-020型全自动生化分析仪（日本日立公司）对患者晨起空腹静脉血标本进行ALT的测定。
1.5　统计学方法
采用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t检验，计数资料用百分率（%）表示，采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　两组患者治疗后CD8+T细胞PD-1、Toll-4水平的比较
观察组CD8+T细胞PD-1及To11-4表达水平均显著低于对照组（P＜0.05）（表1）。
表1　两组患者治疗后CD8+T细胞PD-1、Toll-4水平的比较（±s）

2.2　两组患者治疗后血清乙型肝炎病毒DNA载量、ALT的比较
观察组患者血清乙型肝炎病毒DNA载量、ALT均显著低于对照组（P＜0.05）（表2）。
表2　两组患者治疗后血清乙型肝炎病毒DNA载量、ALT的比较（±s）

2.3　两组患者治疗后临床症状发生率的比较
观察组患者厌食、乏力、恶心呕吐及肝区隐痛的症状发生率显著低于对照组（P＜0.05）（表3）。
表3　两组患者治疗后临床症状发生率的比较［n（%）］

3　讨论
相关研究［6］已经证实，慢性乙型肝炎感染后机体通过激活PD-1/PD-L通路，从而导致PD-1与其配体活化，出现PD-1的表达异常。To11样受体是人体内最为重要的天然兔疫受体，其至少有10个以上的家族成员，其生物学活性主要是提高机体抗感染力，促进机体炎症反应以及促进体内抗原呈递细胞的分化、成熟，进而增加机体的抵抗力［7］。与乙型肝炎患者关系最为密切的To11样受体有To11-4［8］。近年来干扰素α-2a治疗慢性乙型肝炎越来越受到临床重视，本研究从分子生物学角度出发，探讨干扰素α-2a对慢性乙肝患者PD-1及To11-4的影响。
PD-1与配体结合后将导致机体CD8+T淋巴细胞功能障碍而出现机体兔疫力的降低，引起慢性感染的持续存在［9］。在慢性乙肝感染患者体内，乙型肝炎病毒抗原特异性T细胞显著减少，PD-1的表达水平显著升高［10］。观察组患者PD-1的表达水平降低，其原因可能是干扰素α-2a阻断了PD-1/PD-L通路，使体内特异性CD8+T淋巴细胞的功能显著改善，减弱机体对特异性CD8+T细胞的负反馈调节，促使机体T淋巴细胞恢复增殖活性及抗病毒功能［11-15］。对To11-4的研究发现，其识别谱广、生物学活性强，乙型肝炎患者的内毒素是To11-4的主要配体，故内毒素在乙型肝炎发生、发展过程中的作用越来越受到临床研究者的重视［16-17］。在慢性重型乙型肝炎患者的外周血淋巴细胞中，To11-4表达水平显著提高，从而引起机体的慢性炎症反应，并因患者肠道黏膜通透性增高及消化道内细菌的易位，出现肝门静脉以及体循环中内毒素水平的显著提高［18］。观察组患者To11-4表达水平显著降低，可能与干扰素α-2a减少机体炎症反应有关［19-20］。观察组患者血清乙型肝炎病毒DNA载量及血清ALT均显著低于对照组，同时观察组患者厌食、乏力、恶心呕吐及肝区隐痛的发生率显著低于对照组。
综上所述，拉米夫定联合干扰素α-2a治疗能显著降低乙型肝炎病毒DNA水平及CD8+T细胞的PD-1、 To11-4表达水平，提高机体兔疫力，改善肝功能进而改善患者临床症状。
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The effect of PD-1 and Toll-4 exPression in lamivudine combined with interferon α-2a in treating hePatitis B Patients
REN Li-xia　MENG Yan-hong
Department of Pharmaca1，Huanghe Sanmenxia Hospita1 of Sanmenxia City in Henan Province，Sanmenxia　472000，China
［Abstract］Objective To investigate the effect of programmed death receptor 1（PD-1）and To11 receptor 4（To11-4）expression in 1amivudine combined with interferon α-2a treating hepatitis B patients.Methods 100 cases with chronic active hepatitis B from January 2011 to December 2013 in our hospita1 were random1y divided into two groups，each group 50 cases，the contro1 group were used 1amivudine anti-virus，improving immunity，nutritiona1 support and ensuring hepatoprotective，the observation group were combined with interferon α-2a based on the contro1 group，then the PD-1 and To11-4 1eve1 of CD8+T ce11，and HBV DNA 1oading and serum ALT，the present rate of c1inica1 symptoms were compared.Results The PD-1 and To11-4 1eve1 of CD8+T ce11 in the observation group was 1ower than that in contro1 group respective1y（P＜0.05），HBV DNA 1oading and serum ALT in the observation group was 1ower than that in contro1 group respective1y（P＜0.05），the present rate of anorexia，fatigue，nausea，vomiting and 1iver pain in the observation group was 1ower than that in contro1 group respective1y（P＜0.05）.Conclusion Interferon α-2a can significant1y decreased the PD-1 and To11-4 1eve1 of CD8+T ce11，improved immunity，reduced HBV DNA 1eve1s，so it can improve 1iver function.
［Key words］Interferon α-2a；Hepatitis B；Programmed death 1；To11 receptor 4
［中图分类号］R512.6+2
［文献标识码］A
［文章编号］1674-4721（2016）05（b）-0112-04
（收稿日期：2016-01-31　本文编辑：王红双）