王　钦　薛明道　金智华
南通大学附属医院药剂科，江苏南通　226001

[摘要]　目的建立一种去甲斑蝥素片的制备方法，采用HPLC法检测去甲斑蝥素片的含量。方法以去甲斑蝥素为主药，以淀粉、微晶纤维素（MCC）、乳糖为填充剂，以羧甲基淀粉钠（CMS-Na）为崩解剂，以聚乙烯吡咯烷酮-K30（PVP-K30）为黏合剂，以硬脂酸镁为润滑剂，制备去甲斑蝥素片。采用高效液相色谱法（HPLC）检测去甲斑蝥素片的含量；HPLC色谱条件为Spherigel ODS-C18色谱柱；流动相：乙腈-pH 3.1磷酸水溶液（10∶90）（V/V）；流速：1.0 ml/min；柱温：25℃；检测波长：210 nm；进样量：20 μl。选定A（淀粉）、B（MCC）、C（CMS-Na）为考察因素，采用U7（73）均匀设计，通过溶出度指标优化去甲斑蝥素片的制备工艺。结果HPLC标准曲线方程：Y=925.374X-1778.8（r=0.9999）；线性范围：20～800 μg/ml。日内精密度RSD：1.880%、0.172%、0.945%；日间精密度RSD：1.420%、1.126%、1.468%。低、中、高浓度的回收率分别为（98.77±1.24）%、（100.08±1.14）%、（99.59±0.58）%（n=5）。均匀设计回归方程为：K=-0.107-0.004A+0.017B-0.025C-0.0002B2+0.007C2（F=245.312，P＜0.05）；确定优化处方组成为：淀粉10%、MCC 40%、乳糖43%、CMS-Na 7%；验证得溶出速率常数K为（0.332±0.019）/min。结论按优选处方制备的去甲斑蝥素片外形美观，流动性、润滑性、压缩成形性均良好；采用HPLC法可有效控制片剂质量。

[关键词]　去甲斑蝥素片；高效液相色谱；溶出度；均匀设计

去甲斑蝥素是人工合成的新型抗癌药物，其作用机制在于促进肿瘤细胞及感染的细胞死亡，在G2期与M期特异性地抑制肿瘤细胞的增殖及癌细胞DNA的合成，干扰细胞分裂，破坏癌细胞骨架及其超微结构，提高癌细胞呼吸控制率，调节机体免疫力；在抗癌的同时，可减少机体的不良反应。另外，去甲斑蝥素还具有升高白细胞的作用[1-3]，可用于原发性肝癌、消化道肿瘤，也适用于白细胞低下症、肝炎、肝硬化、乙型肝炎病毒携带者[4-5]。本研究制备去甲斑蝥素片，并采用高效液相色谱法（HPLC）评价其制剂质量，以期建立一种有效的药品检验方法，获得优化的去甲斑蝥素片制备工艺，有利于获得较好的抗肿瘤临床疗效。

1.1　试药与仪器

1.1.1　药品与试剂去甲斑蝥素（山东信谊制药有限公司，批号20130906）；淀粉（濮阳市华鲁药用辅料有限公司）；微晶纤维素（MCC，曲阜市天利药用辅料有限公司）；乳糖（镇江市康富生物工程有限公司）；羧甲基淀粉钠（CMS-Na，安徽山河药用辅料有限公司）；聚乙烯吡咯烷酮-K30（PVP-K30，博爱新开源制药股份有限公司）；硬脂酸镁（山东聊城阿华制药有限公司）；去甲斑蝥素标准品（上海永叶生物科技有限公司）；乙腈（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；其他试剂均为分析纯。

1.1.2　仪器　美国Agilent 1100 Series型高效液相色谱系统（紫外检测器，四元泵，Agilent 1100工作站，手动进样器，在线真空脱气机）；Spherigel ODS-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）（瑞士Spherigel公司）；ZP19型旋转式压片机（扬州诺亚机械有限公司）；ZRS-4型智能药物溶出试验仪（天津大学无线电厂）。

1.2　去甲斑蝥素的测定方法

1.2.1　HPLC色谱条件　色谱柱：Spherigel ODS-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-pH 3.1磷酸水溶液（10∶90）（V/V）；流速：1.0 ml/min；柱温：25℃；检测波长：210 nm；进样量：20 μl。

1.2.2　HPLC标准曲线　精密称取100 mg去甲斑蝥素标准品加入0.2%乙酸溶液，配制成1.0 mg/ml贮备液。分别稀释成浓度为800、400、200、100、50、25、20 μg/ml标准溶液，进样20 μl，以峰面积（Y）对质量浓度（X，μg/mL）回归得标准曲线方程。

1.2.3　精密度　配制25、200、600 μg/ml去甲斑蝥素0.2%乙酸溶液，连续进样5次，计算日内精密度。另取25、200、600 μg/ml去甲斑蝥素0.2%乙酸溶液，连续5 d进样，测得日间精密度。

1.2.4　回收率　精密称取35 g研碎的空白片，分别加入0.1、5、20 g去甲斑蝥素，用适量0.2%乙酸溶液充分溶解和分散，并用0.2%乙酸溶液定容至50 ml，用移液管吸取上述溶液1 ml加入100 ml容量瓶中，用0.2%乙酸溶液定容，过0.45 μm微孔滤膜，HPLC进样20 μl，测定去甲斑蝥素的浓度，代入标准曲线方程，计算低（20 μg/ml）、中（100 μg/ml）、高（400 μg/ml）浓度的回收率。

1.3　去甲斑蝥素片的制备方法

称取处方量去甲斑蝥素，与辅料淀粉、MCC、乳糖、CMS-Na混合均匀，过80目筛，加适量黏合剂5% PVP-K30乙醇溶液制软材，过14目筛制粒，湿粒在50～60℃干燥，过14目筛整粒，称干颗粒的重量，再加入颗粒重量的1%硬脂酸镁混匀。用直径9 mm的冲头将颗粒在合适压力下压片，即得。

1.4　溶出度试验

按照《中国药典（2010年版）》附录ⅩC溶出度测定法中的第二法——桨法进行，以0.1 mol/L HCl溶液900 ml为溶出介质，于恒温（37±0.5）℃、转速100 r/min下进行。于0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、15、20、30min定时取样10 ml，同时补加同温介质10ml，立即用0.45 μm微孔滤膜滤过样品。取滤液，采用HPLC法测定并计算每片的累积溶出百分率。

1.5　片剂处方优选

采用均匀实验设计优化处方，对每个方案进行溶出度试验，利用单指数函数进行拟合，以溶出速率常数（K）为处方优选指标，得到优化的处方。

1.6　统计学方法

采用统计软件SPSS 15.0对实验数据进行分析，因素分析采用方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1　去甲斑蝥素的测定

2.1.1　HPLC标准曲线　以峰面积（Y）对质量浓度（X，μg/ml）回归得标准曲线方程：Y=925.374X-1778.8（r= 0.9999），线性范围：20～800 μg/ml。

2.1.2　精密度日内精密度RSD分别为1.880%、0.172%、0.945%。日间精密度RSD分别为1.420%、1.126%、1.468%。

2.1.3　回收率　低、中、高浓度的回收率分别为（98.77± 1.24）%、（100.08±1.14）%、（99.59±0.58）%（n=5）。

2.2　去甲斑蝥素片制备工艺的优化

经单因素考察预实验发现，影响去甲斑蝥素片溶出度的主要因素为片剂处方中填充剂、崩解剂和润滑剂的含量百分比[6]，而加入1%硬脂酸镁有利于压片，且制得的去甲斑蝥素片色泽、硬度、光洁度良好。因此，选定A（淀粉）、B（MCC）、C（CMS-Na）为考察因素，采用U7（73）均匀实验设计，因素水平表见表1。对每个方案制成的去甲斑蝥素片进行溶出度试验，利用单指数函数进行拟合，以K为处方优选指标，设计结果见表2。

表1　U7（73）均匀设计因素水平表

表2　U7（73）均匀设计结果

以三因素A、B、C为自变量，以K为因变量，对以上数据进行回归分析，得到线性回归方程为：K=-0.107-0.004A+0.017B-0.025C-0.0002B2+0.007C2，方差分析结果显示差异有统计学意义（F=245.312，P＜0.05），因而该回归方程可信。由回归方程可知，当A取值10，B取值42.5，C取值7时候，因变量K在自变量的取值区间内有最大值（0.381）。根据回归方程的优化结果，最终确定优化处方组成：淀粉10%、MCC 40%、乳糖43%、CMS-Na 7%。

2.3　优化工艺的验证试验

按优选处方制备4批去甲斑蝥素片，分别进行溶出度试验，得到溶出曲线（图1）。结果制得的片剂外形美观，流动性、润滑性、压缩成形性均良好，其t50为（1.43±0.02）min，td为（2.28±0.07）min，平均溶出速率常数K为（0.332±0.019）/min。

 

图1　去甲斑蝥素片的溶出曲线

去甲斑蝥素对常见肿瘤细胞的生长有抑制作用，能明显减轻斑蝥素对泌尿系统强烈的刺激性，保持较强的抗肿瘤活性和独特的升高白细胞作用，能在细胞毒性、诱导凋亡、抗黏附转移、抑制肿瘤血管生成等多个环节发挥抗癌作用[7-9]。去甲基斑蝥素难溶于水，但易水解，水解产物去甲斑蝥酸具有良好的水溶性（93 g/L，20℃）。去甲斑蝥素在人工胃液中以去甲斑蝥酸的形式存在，而在中性和弱碱性溶液中，会以去甲斑蝥酸根离子的形式存在[10]。本研究发现将去甲斑蝥素溶于酸性水中，即其完全以去甲斑蝥酸存在时，有利于HPLC法的检测。这是由于在中性和弱碱性溶液中，部分存在的去甲斑蝥酸根离子会造成HPLC色谱图上出现杂峰，引起检测数据不准。因此，本研究采用乙腈-pH 3.1磷酸水溶液（10∶90）（V/V）作为流动相，并用去甲斑蝥素的0.2 %乙酸溶液作为检测样品。

去甲斑蝥素作为一种水溶性药物，对湿度较敏感，用PVP的乙醇溶液作黏合剂可消除水、热等因素的影响。PVP作为黏合剂时既可用干粉作为干黏合剂，也可用适当溶剂润湿制粒后压片，其亲水性良好，可改善压片时的脱片现象[11]。本研究采用5%PVP-K30乙醇溶液作为黏合剂，制得的干燥颗粒具有外形美观，流动性好、耐磨性较强、压缩成型性好等优点。

去甲斑蝥素片为抗肿瘤药物的常释制剂，可用于肿瘤化疗的联合给药，需要较好的溶出速率以保证配合其他肿瘤化疗药物，获得良好的临床疗效，因此本研究以K为处方优选指标。片剂处方优选方程表明，淀粉的加入不利于片剂的溶出，乳糖的加入有利于片剂的溶出，而在一定范围内增加崩解剂CMS-Na的量可有利于去甲斑蝥素的溶出。尽管加入较大比例的淀粉有利于降低生产成本，但是过多的淀粉可导致片剂的溶出速率慢[12]。CMS-Na作为高效能崩解剂具有很大的比表面积与孔隙率，具有很好的吸水速度，同时其吸水膨胀效果非常显著，其吸水后可膨胀为原体积的300倍，因此CMS-Na可改善片剂的崩解过程[13]。研究发现淀粉含量在50%以上时制备的去甲斑蝥素片在80 min后尚有片剂的残留物。优化后的去甲斑蝥素片在15 min内可实现100%溶出，t50为（1.43± 0.02）min，td为（2.28±0.07）min，说明优选后的处方可有效提高去甲斑蝥素的溶出速率。

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·药物研究·

Preparation process and content determination of Norcantharidin tablets

WANG Qin XUE Ming-dao JIN Zhi-hua
Department of Pharmacy，the Affiliated Hospital of Nantong University，Jiangsu Province，Nantong 226001，China

[Abstract]　Objective To establish a preparation method of Norcantharidin tablets，and to detect content of Norcantharidin Tablets by using HPLC method.Methods Norcantharidin tablets were prepared with norcantharidin as the main drug，microcrystalline cellulose (MCC) and lactose as the fillers，sodium carboxymethyl starch (CMS-Na) as the disintegrating agent，polyvinylpyrrolidone K30(PVP-K30) as adhesive.Content of Norcantharidin tablets was detected with the method of HPLC；HPLC chromatographic conditions were: Spherigel ODS C18chromatographic column；mobile phase: acetonitrile - pH 3.1 phosphoric acid aqueous solution (10∶90) (V/V)；the flow rate of 1.0 ml/min；column temperature 25℃；detection wavelength of 210 nm；sample quantity 20 μl.The factors A (starch)，B (MCC) and C (CMS-Na) were selected，U7(73) uniform design was adopted，and preparation of Norcantharidin tablets was optimized through the dissolution index.Results HPLC standard curve equation: Y=925.374X-1778.8 (r=0.9999)；linear range: 20～800 μg/ml.The intra-day precision RSD were 1.880%，0.172%，0.945%；inter-day precision RSD were 1.420%，1.126% and 1.468%.Coefficient of recovery in low，medium and high concentrations were separately (98.77±1.24)%，(100.08±1.14)%，(99.59± 0.58)% (n=5).Uniform design regression equation was K=-0.107-0.004A+0.017B-0.025C-0.0002B2+0.007C2(F=245.312，P＜0.05)；the optimized prescription composition was 10% starch，40% MCC，43% lactose and 7% CMS-Na；dissolution rate constant K was validated of (0.332±0.019)/min.Conclusion Norcantharidin tablets prepared with the optimized prescription preparation are with beautiful shape，good liquidity，lubricity and compression formability；HPLC method can effectively control the quality of tablets.

[Key words]　Norcantharidin tablets；High performance liquid chromatography；Dissolution；Uniform design

[中图分类号]　R927　

[文献标识码]　A　

[文章编号]　1674-4721（2016）01（c）-0086-04

[作者简介]　王钦（1985-），男，江苏东台人，硕士，药师，研究方向：医院药学、药物新剂型与新技术

收稿日期：（2015-10-22　本文编辑：卫轲）