·基础医学·

黄敏东　邹剑丹
广东省揭阳市人民医院神经外科，广东揭阳　522000

[摘要]　目的探讨大鼠脑挫裂伤合并硬膜下血肿模型中TNF-α及IL-1β的表达情况。方法将120只大鼠随机分为正常组60只和模型组60只。利用球囊内注水后快速解压制作脑挫裂伤合并硬膜下血肿模型，在6、12、24 h，模型组行开颅取脑组织，SP免疫组织化学检测脑组织TNF-α及IL-1β的表达。结果6、12、24 h，模型组大鼠脑组织中TNF-α及IL-1β水平显著升高，而正常组对应的TNF-α、IL-1β表达水平则明显降低，两组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论在脑挫裂伤合并硬膜下血肿模型中，TNF-α及IL-1β表达水平在伤后6、12、24 h明显增高，提示出现脑损伤、脑水肿。

[关键词]　硬膜下血肿；脑外伤；TNF-α；IL-1β

在颅脑外伤的患者中，可经常见到急性硬膜下血肿，且多伴脑挫裂伤，两者均可继发脑水肿，在受损位置产生占位效应，压迫、推移周围脑组织，导致颅内压力升高，严重者可使中线结构移位，脑干受压，从而引发脑疝，造成严重后果[1-2]。本实验通过建立大鼠脑挫裂伤合并硬膜下血肿的动物模型，尽量贴近该临床实际，并研究了损伤模型中TNF-α和IL-1β的表达情况，为该类脑损伤的治疗方案研究提供必要依据。

1.1　实验分组

研究对象为汕头大学医学院提供的120只Wistar大鼠，许可证号：SYXK（粤）2012-2010，雌雄不限，体重200～250 g，随机分为模型组和正常组，各60只，两组大鼠的体重、性别等一般资料差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2　模型制作

模型组大鼠采用40 mg/kg的2.5%戊巴比妥进行腹腔麻醉，固定于试验台后常规消毒铺巾，切开头皮，显露双侧顶骨，在左侧造成约0.3 cm直径的颅骨缺损后（保持硬膜完整）。将球囊置入左侧硬膜外腔，逐渐向球囊内注入生理盐水使其扩张，5 min内注入0.1 ml，在1 s内迅速完成解压，压迫侧眼球瞳孔缩小，呼吸无明显变化。正常组未作任何处理。

1.3观察指标、组织取材方法及病理学观察

1.3.1　观察指标观察手术过程中至术后24 h内的大鼠活动、精神以及神经技能改变情况。

1.3.2　组织取材方法术后24 h仍存活的大鼠采用心脏灌注法处死，大鼠死亡后开颅取材，观察大鼠的硬膜外是否存在血肿、凹陷等现象，脑皮质是否出现肿胀、苍白等表现，颅内是否有出血现象等，标本常规脱水切片，HE染色观察。

1.3.3　病理学观察　TNF-α和IL-1β水平采用SP免疫组织化学法镜下观察。免疫组织化学方法：①损伤处脑组织，4%多聚甲醛固定2 h。②30%蔗糖溶液浸泡48 h，冷冻切片，层厚10 μm，置于多聚赖氨酸包被的载玻片上晾干。③三羟甲基氨基甲烷缓冲液冲洗5 min，加5%正常山羊封闭液，温室孵育1 h。④去血清，加一抗试剂，置于4℃冰箱。⑤磷酸盐缓冲液冲洗5 min，室温下孵育30 min，磷酸盐缓冲液冲洗5 min，洗3次。⑥梯度乙醇脱水，中性树脂封片。⑦镜下观察：一抗TNF-α试剂由北京中杉金桥公司提供，单克隆抗体则由Santa Cruz提供，观察神经、胶质、血管内皮细胞胞质内的TNF-α情况，如出现棕黄色颗粒则视为阳性表达；一抗IL-1β由武汉博士德公司提供，阳性表现为胞质黄染。

1.4　统计学处理

采用SPSS 16.0软件处理数据，计量资料采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1　神经功能变化及饮食

模型组大鼠无一例死亡，压迫侧瞳孔缩小明显，术后仍能自主觅食但活动行为减少，出现明显烦躁表现；正常组大鼠未出现上述变化。

2.2　肉眼大体改变

模型组硬膜完整但明显可见硬膜下血肿；正常组无异常改变。

2.3　光学显微镜检查

模型组皮质有不同程度的出血现象，炎性细胞大量聚集，部分大鼠有脑水肿现象；正常组未见明显异常。

2.4　TNF-α和IL-1β的表达

标本免疫组织化学染色后，模型组中TNF-α和IL-1β呈棕黄色颗粒，位于细胞质内（图1、图2）。表达阳性的有胶质细胞、神经细胞和血管内皮细胞，主要分布于大脑半球皮质内。正常组两者极少表达（图3、图4）。两组TNF-α、IL-1β阳性细胞数结果见表1、表2。

 

图1　模型组TNF-α（×400）

 

图2　模型组IL-1β（×400）

 

图3　正常组TNF-α（×400）

 

图4　正常组IL-1β（×400）

表1　两组TNF-α阳性细胞数的比较（个/镜下视野）

表2　两组IL-1β阳性细胞数的比较（个/镜下视野）

关于硬膜下血肿模型的制作，有学者尝试将大鼠自体血快速注入硬膜下腔，从而引发颅内压快速升高，也能够达到模拟急性硬膜下血肿患者的相关病理变化，但在临床上，急性硬膜外血肿患者常伴随脑挫裂伤，为了更好地模拟这个受伤过程，本研究利用大鼠制作了该类型损伤的动物模型。从本实验结果看，肉眼可见硬膜完整，硬膜下有血肿，镜下模型组脑皮质见局灶性出血，血管周围组织可见明显间隙、炎性细胞聚集，提示脑水肿，说明动物模型的制作是成功的。

在发生脑挫裂伤合并硬膜下血肿时，脑挫裂伤本身可造成脑细胞损伤及水肿，硬膜下血肿直接压迫脑组织，会不同程度地造成脑组织损伤。从本实验的病理改变来看，模型组大鼠解压后受压迫组织有血管组织解剖结构改变及炎性细胞聚集，提示脑水肿的发生。Tsuchida等[3]在20世纪末通过MRI检查发现大鼠硬膜下血肿早期可观察到缺血、水肿现象，由此可知在该模型符合临床上出现的脑挫裂伤合并硬膜下血肿所产生的病理改变。

脑组织中TNF-α及IL-1β主要由神经元和胶质细胞产生，是组织损伤后出现的一类具有多重生物学效应的炎性因子。在本实验中，模型组在受伤后6、12、24 h均出现TNF-α及IL-1β的明显表达，提示两者在脑外伤后出现的一系列反应中发挥一定的作用，特别是在伤后脑水肿中扮演重要的角色。

对于急性颅脑外伤患者而言，TNF-α是导致炎症发生的首要因素，也是最早出现升高的细胞因子，TNF-α能促进炎性介质的释放，加速白细胞和炎症细胞的聚集，提高中性粒细胞的黏附作用，加速细胞凋亡，在脑组织损伤的过程中有重要作用[4]，也就是说，TNF-α是作为启动因素来参与到颅脑损伤的炎性反应中的，而随着病变的进一步加深，TNF-α持续升高，开始广泛作用于脑细胞，参与到继发性病变中，对脑组织造成二次损害[5-6]。从本实验结果来看，TNF-α在脑外伤后6 h已经明显表达，在6、12、24 h分别为（12.2±3.3）、（13.5±4.3）、（13.7±3.3）个/镜下视野，持续保持较高状态且有稍微增加的趋势，与各时期正常组的TNF-α表达数差异有统计学意义（P＜0.05），这说明其诱导的脑水肿、细胞损伤亦有加重的趋势，所以如能中断TNF-α的表达及其产生的反应，则有可能减轻伤后出现的脑水肿、脑损伤，而从IL-1β的表达情况来看，伤后模型组小鼠在6、12、24 h分别为（10.9± 4.7）、（12.7±3.3）、（15.2±6.3）个/镜下视野，保持持续升高状态，与各时期正常组的IL-1β表达数差异有统计学意义（P＜0.05），颅脑损伤后机体IL-1β的mRNA在1～3 h内持续增加，这进一步肯定了早期脑水肿会不断加重的情况[7]。IL-1β可引发脑水肿，加重局部的炎性反应，并通过诱导Rax基因的表达来加速神经细胞凋亡[8-9]。IL- 1β能延长癫痫发作时间，IL-1Ra则有抗惊厥作用[10-13]，考虑到癫痫发作与神经细胞损伤密切关联，所以认为IL-1β会加重神经元的损害而IL-1Ra则会拮抗性地保护神经元细胞。在本实验中，IL-1β在伤后6 h呈明显表达，且表达增加趋势较明显，符合临床上早期脑水肿不断加重的事实[14-18]。鉴于IL-1β可直接或间接地损伤神经细胞，阻断它的作用，估计可在一定程度上避免伤后的脑细胞损伤。

综上所述，在脑挫裂伤合并硬膜下血肿模型中，TNF-α及IL-1β的表达在伤后6、12、24 h明显增多，提示出现脑损伤、脑水肿。此实验对脑损挫裂伤并硬膜下血肿的基础研究有重要价值。

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Research of TNF-α and IL-1β expression in cerebral contusion and laceration complicated with subdural hematoma in rats

HUANG Min-dong ZOU Jian-dan
Department of Neurosurgery，Jieyang People's Hospital in Guangdong Province，Jieyang 522000，China

[Abstract]　Objective To explore the expression of TNF-α and IL-1β in cerebral contusion and laceration complicated with subdural hematoma in rats.Methods One hundred and twenty rats were evenly divided into normal group and model group in random.The cerebral contusion and laceration complicated with subdural hematoma model was established by rapid decompression after injecting water using sacculus.Brain tissue was taken by craniotomy at 6 h，12 h and 24 h in model group.The expression of TNF-α and IL-1β in brain tissue were detected by SP immunohistochemistry.Results The TNF-α and IL-1β expression level in brain tissue at 6 h，12 h and 24 h in model group was greatly improved respectively，while the corresponding expression level in normal group was obviously decreased respectively，and there was a statistical difference between two groups (P＜0.05).Conclusion In the model of cerebral contusion and laceration complicated with subdural hematoma，expression level of TNF-α and IL-1β is greatly increase after 6 h，12 h and 24 h trauma，and it indicates that cerebral injury or edema.

[Key words]　Subdural hematoma；Cerebral trauma；TNF-α；IL-1β

[中图分类号]　R332　

[文献标识码]　A　

[文章编号]　1674-4721（2016）01（c）-0105-04

[作者简介]　黄敏东（1981-），男，广东揭阳人，硕士，主治医师

收稿日期：（2015-05-13　本文编辑：许俊琴）