李铭
广西壮族自治区北海食品药品检验所，广西北海　536000

[摘要]目的建立高效液相色谱-串联质谱法测定益母草颗粒中盐酸水苏碱含量的方法。方法色谱条件采用Agilent SB-C18柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm），以乙腈-0.2％冰乙酸（70︰30）为流动相，流速为0.3 ml/min。质谱检测采用正离子电喷雾离子源（ESI＋），在多反应监测模式（MRM）下检测，监测离子（m/z）分别为：144/58、144/84。结果盐酸水苏碱浓度在0.2～10.0 μg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系（r＝0.9992），平均回收率为102.6％，RSD 为1.5％（n＝6）。结论该方法快速简便、专属性强、结果准确，可用于益母草颗粒的质量控制。

[关键词]益母草颗粒；盐酸水苏碱；高效液相色谱-串联质谱法

益母草颗粒是由益母草水提取物为主要原料加蔗糖、糊精等辅料经适当加工而成的妇科常用中成药，具有活血调经止痛等功能，临床上用于治疗经闭、痛经、产后瘀血腹痛及产后恶露不绝、经量少、淋漓不净、产后出血时间过长、产后子宫复旧不全等。益母草中的主要活性成分为盐酸水苏碱。益母草颗粒为《中国药典》2010年版一部收载品种[1]，其对益母草中的盐酸水苏碱含量测定采用薄层色谱扫描。该方法影响因素多，数据重现性差。部分文献[2-20]采用高效液相色谱法，选用紫外检测器[2-14]、蒸发光检测器[15-19]、示差折光检测器[20]测定益母草制剂中盐酸水苏碱的含量。其大多数使用较特别的色谱柱，如氨基色谱柱、磺酸基阳离子交换色谱柱、丙烯酰胺色谱柱，且样品提取过程复杂，操作不简便。本文采用高效液相色谱-串联质谱法，利用质谱较高的选择性和专一性，只用普通的C18反相色谱柱，只需简单的超声提取即能完成对益母草颗粒中盐酸水苏碱含量的测定，而该方法国内文献未被报道过。测定结果表明，该方法操作简便、专属性强、灵敏度高、结果准确可靠，可用于该制剂的质量控制。

美国Agilent 1290高效液相色谱仪，Agilent 6460三重四极杆串联质谱；AX205DU电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；SK250超声波清洗器（上海科导仪器有限公司，250 W，35 kHz）。

盐酸水苏碱对照品（中国食品药品检定研究所，含量：99.0％，批号：110712-201010）供含量测定用；益母草颗粒（A厂：批号130304；B厂：批号140402；C厂：批号130402），为市售品；乙腈为色谱纯，水为市售娃哈哈纯净水，冰乙酸为优级纯，其余检测用试剂均为分析纯。

2.1　色谱及质谱条件

2.1.1　色谱条件　色谱柱为Agilent SB-C18柱（50 mm× 2.1 mm）；流动相为乙腈-0.2％冰乙酸（70︰30）；流速为0.3 ml/min；柱温为30℃；进样量为5 μl。

2.1.2　质谱条件　离子源为大气压电喷雾离子源（ESI源），选择扫描方式为正离子，采用全扫描、选择离子扫描及二级全扫描；雾化气压力：30 Psi（1 Psi＝6890 Pa），干燥气温度：300℃，辅助气（N2）流速：8.0 L/min，离子源Vcap毛细管电压：4000 V，含量测定监测方式为多反应监测模式（MRM），盐酸水苏碱定性离子质荷比（m/z）144/84，定量离子质荷比144/58；定性和定量离子对应的碰撞能量压分别为22、26 V，碎裂电压均为128 V。

2.2　溶液的制备

2.2.1　对照品溶液的制备　精密称取盐酸水苏碱对照品12.55 mg，置25 ml量瓶中，加70％乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得浓度为0.497 mg/ml对照品贮备溶液。精密量取对照品贮备液1 ml，置25 ml量瓶中，加70％乙醇稀释至刻度，摇匀，即得浓度为19.9 μg/ml的对照品使用溶液。

2.2.2　供试品溶液的制备取本品5包颗粒内容物，研细混匀，称取约5 g重量，精密称定，置50 ml量瓶中，加70％乙醇约40 ml，超声处理（功率250 W，频率35 kHz）20 min，取出放冷至室温，加70％乙醇稀释至刻度，摇匀、过滤，精密量取续滤液2 ml置100 ml量瓶中，加70％乙醇定容至刻度，摇匀，经微孔滤膜（0.45 μm）过滤，取续滤液，即得。

2.2.3　阴性对照溶液的制备　按药品标准中的处方比例和制法制备不含益母草的阴性样品，照供试品溶液的制备方法操作制备阴性对照溶液。

2.3　专属性考察试验

精密量取上述对照品使用溶液，供试品溶液，阴性对照溶液各5 μl注入高效液相色谱-质谱联用仪，按上述色谱及质谱条件下测定，记录色谱图，结果盐酸水苏碱的保留时间约为3.5 min，溶液内的其他杂质不干扰样品中的盐酸水苏碱分离测定，阴性样品在盐酸水苏碱色谱峰相应的保留时间处未见干扰峰出现，表明方法的专属性良好（图1）。

2.4　线性关系考察试验

精密量取上述对照品使用溶液0.1、0.5、1、2、5 ml分别置10 ml容量瓶中，用70％乙醇定容至刻度，摇匀，即得一系列浓度的标准曲线对照品液。取每个浓度的标准曲线对照品液各5 μl分别注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定，记录峰面积，进行线性考察。以浓度（X）对峰面积（Y）进行线性回归，得回归方程Y＝31.96X＋3.94×103（r＝0.9992）。结果表明，盐酸水苏碱在0.2～10.0 μg/ml的浓度范围内有良好的线性关系。

 

图1　盐酸水苏碱的色谱图
A.对照品；B.样品；C.阴性样品

2.5　重复性试验

取同一批号样品（批号：130304）共6份，按供试品溶液的制备方法平行配制6份供试品溶液，同法测定，测得平均含量为6.0265 mg/g，RSD为1.67％，表明方法有较好的重复性。

2.6　精密度试验

取盐酸水苏碱对照品使用溶液5 μl，注入高效液相色谱仪，连续进样5次，结果峰面积的RSD为0.77％，表明分析方法精密度良好。

2.7　稳定性试验

精密吸取同一份供试品溶液5 μl，分别在0、2、4、6、8、10、12、16、20 h按上述色谱条件下进行测定，结果盐酸水苏碱峰面积RSD为1.1％，表明在20 h内供试品溶液中盐酸水苏碱峰面积无明显变化，供试品溶液在20 h内稳定。

2.8　加样回收率试验

取同一批号（批号：130304）的已知含量样品5包，取颗粒研细混匀，称取6份约2.5 g细粉，精密称定，分别置50 ml量瓶中，分别精密加入盐酸水苏碱对照品适量，分别加70％乙醇约40 ml，超声处理20 min，取出放冷，加70％乙醇稀释至刻度，摇匀、过滤，分别取续滤液2.00 ml，用70％乙醇定容至100 ml量瓶，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为回收率测定的供试品溶液。再按上述色谱及质谱条件下进样，测定盐酸水苏碱峰面积，按标准曲线测得含量，计算加样回收率。结果平均回收率为102.6％，RSD为1.5％（表1）。

表1　加样回收率试验测定结果（n＝6）

2.9　样品含量测定

取不同生产厂家样品3批，按上述供试品溶液的制备方法配制供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录峰面积，代入线性方程计算含量。3个厂家3个批号样品含量测定结果见表2。

表2　样品含量测定结果（n＝3）

3.1　提取时间的选择

在供试品溶液的制备上，本实验通过对不同超声的提取时间（10、20、30、40 min）进行考察，结果显示，超声提取20 min已将样品中的盐酸水苏碱提取完全。

3.2　流动相比例的选择

在流动相的选择上，流动相中乙腈与0.2％冰乙酸的比例经过多次配比试验，当乙腈︰0.2％冰乙酸＝70︰30时样品中的其他成分对盐酸水苏碱的测定无干扰，且盐酸水苏碱的出峰时间适当，峰形、理论塔板数均较理想，故选用该比例进行测定。

3.3　质谱条件的选择

在对质谱条件的优化考察中，为使盐酸水苏碱的各子离子峰信号达到最强，以正、负离子模式分别进行检测，进行二级质谱扫描并通过优化裂解电压以及碰撞能压，经多次实验达到最佳的质谱条件。

3.4　本实验方法的优点

益母草颗粒的原质量标准中的含量测定采用薄层色谱扫描法测定，其处理较为繁琐，测定时间长，数据重现性差，而高效液相色谱法，色谱柱选择要求条件高，样品提取过程复杂，部分方法采用检测器灵敏度低。本文采用高效液相色谱-串联质谱法测定益母草颗粒中盐酸水苏碱的含量，具有较高的选择性和专一性，灵敏度高，色谱柱选择较普通常用，操作简便、重复性好。

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LI Ming
Institute for Food and Drug Control of Beihai in the Guangxi Zhuang Autonomous Region,Beihai 536000,China

[Abstract] Objective To establish a method of high performance liquid chromatography（HPLC）-tandem mass spectrometry determining the content of stachydrine hydrochloride from Motherwort granule. Methods The chromatographic conditions were Agilent SB-C18column（50 mm×2.1 mm,1.8 μm）,acetonitrile to 0.2％glacial acetic acid（70︰30）as the mobile phase,and a flow rate of 0.3 ml/min.Positive ion electrospray ionization（ESI＋）was applied for mass spectrometric detection under multiple reaction monitoring（MRM）mode.The monitored ions（m/z）was 144/58,144/84 respectively. Results The concentration of stachydrine hydrochloride being within 0.2 μg/ml to 10.0 μg/ml had a good linear relationship with the peak area.The r value was 0.9992,and the average recovery was 102.6％and the value of RSD was 1.5％（n＝6）. Conclusion The method is fast,simple,specific,and accurate in outcome,which can be used for quality control of Motherwort granule.

[Key words] Motherwort granule;Stachydrine hydrochloride;High performance liquid chromatography -tandem mass spectrometry

收稿日期：（2015-06-09本文编辑：王红双）

[作者简介]李铭（1975-），男，广西大新县人，本科，主管药师，主要从事食品、药品检验工作

[中图分类号] R284.1　

[文献标识码] A　

[文章编号] 1674-4721（2016）01（b）-0008-03