神经生长因子对大鼠肝星状细胞转化生长因子-β1及Smad蛋白通路的影响
朱海燕 吴雄健 叶艳清 曾 斌 谢志军
赣南医学院第一附属医院消化内科,江西赣州 341000
[摘要]目的 研究神经生长因子(NGF)对大鼠肝星状细胞-T6(HSC-T6)增殖、凋亡的影响以及大鼠HSC-T6中转化生长因子-β1(TGF-β1)/Smad蛋白通路的变化,探讨NGF影响 HSC-T6增殖及凋亡的可能作用机制。方法 体外培养大鼠HSC-T6,将HSC-T6与不同浓度的NGF孵育,分为对照组(0 ng/ml NGF)、实验组(100 ng/ml NGF),应用流式细胞术检测HSC-T6凋亡情况,通过XTT法了解NGF对HSC-T6增殖的影响;免疫细胞化学法观察NGF对HSC作用后TGF-β1、Smad3、Smad7表达的变化。结果 实验组(OD值为0.65±0.03)对HSC-T6的增殖抑制作用与对照组(OD值为0.73±0.01)比较,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组的凋亡率高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,实验组的 TGF-β1、Smad3 表达明显降低,Smad7 表达明显升高(P<0.05)。 结论 NGF可抑制HSC-T6增殖、促进其凋亡,其机制可能与调节TGF-β1/Smad蛋白通路有关。
[关键词]肝星状细胞;凋亡;神经生长因子;转化生长因子-β1
[中图分类号]R332
[文献标识码]A
[文章编号]1674-4721(2018)8(c)-0004-04
[基金项目]江西省卫生计生委科技计划项目(20175347);江西省教育厅科研项目(GJJ170859)
[作者简介]朱海燕(1985-),女,硕士,主治医师,研究方向:消化系疾病的基础与临床研究
Influence of nerve growth factor on transforming growth factor-β1 and Smad protein pathway in rat hepatic stellate cell
ZHU Hai-yan WU Xiong-jian YE Yan-qing ZENGBin XIE Zhi-jun
Department of Gastroenterology,the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University,Jiangxi Province,Ganzhou 341000,China
[Abstract]Objective To study the influence of nerve growth factor(NGF)on the proliferation and apoptosis of hepatic stellate cell-T6(HSC-T6)and transforming growth factor-β1(TGF-β1)/Smad protein pathway change in HSC-T6 of rat,and explore the possible mechanism of NGF influencing HSC-T6 proliferation and apoptosis.Methods HSC-T6 of rat was cultured in vitro.HSC-T6 was incubated with different concentrations of NGF and divided into the control group(0 ng/ml NGF)and experimental group(100 ng/ml NGF).The flow cytometry was used for detection of HSC-T6 apoptosis.By XTT,the influence of NGF on the proliferation of HSC-T6 was understood.The expression of TGF-β1,Smad3 and Smad7 after NGF affecting on HSC was observed by immunocytochemistry.Results The inhibition of HSC-T6 proliferation in theexperimental group(OD valuewas0.65±0.03)wassignificantly different fromthat in the control group(OD value was 0.73±0.01)(P<0.05).The apoptosis rate of the experimental group was higher than that of the control group with a statistical difference(P<0.05).The expression of TGF-β1 and Smad3 in the experimental group was down-regulated significantly,while the expression of Smad7 was greatly up-regulated compared with those in the control group(P<0.05).Conclusion NGF can inhibit the proliferation of HSC-T6 and promote its apoptosis.The mechanism may be related to the regulation of TGF-β1/Smad protein pathway.
[Key words]Hepatic stellate cell;Apoptosis;Nerve growth factor;Transforming growth factor-β1
肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的活化是慢性肝病进展的中心环节[1]。近期的研究表明,神经生长因子(nerve growth factor,NGF)可诱导 HSC 凋亡,但其相关作用机制尚未明确。TGF-β1是目前为止公认最强的致肝纤维化细胞因子[2],HSCTGF-β1/Smads信号通路的激活及其所导致的病理变化在肝纤维化的发生、发展中具有非常重要的作用。本研究主要探讨NGF影响HSC增殖及凋亡的可能作用机制,寻找防治肝纤维化的新途径。
1 材料与方法
1.1 材料
NGF购自美国RD公司;AnnexinⅤ-FITC购自美国罗氏公司;TGF-β1、Smad3、Smad7 抗体购自武汉博士德公司;S-P超敏试剂盒(鼠/兔)及DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司;DMEM培养液及胎牛血清购自美国Gibco公司。HSC系HSC-T6由上海中医药大学徐列明教授提供,系SV40转染后的大鼠HSC,具有活化HSC表型。
1.2 方法
HSC-T6的培养与传代:使用 DMEM培养液(含100 U/ml青霉素,100 U/ml链霉素,10%胎牛血清)进行培养。设定培养温度37℃,CO2浓度5%,湿度饱和。予隔天进行1次换液。待细胞密度达80%~90%,以0.02%EDTA和0.25%胰蛋白酶分散细胞,按1∶4传代。根据加入NGF浓度的不同分为对照组 (0 ng/ml NGF)及实验组(100 ng/ml NGF)。
1.2.1 NGF对HSC-T6增殖的作用 取对数生长期细胞,细胞悬浮液浓度调至7×104/ml,接种于96孔板中,每孔 200 μl,24 h后弃上清,加入各浓度 NGF,两组各设4个复孔,培养24 h,而后将预配的 XTT比色液50μl分别加入各孔,置于培养箱中再孵育4 h。使用酶标仪测定吸光值(OD值),设定主波长570 nm,参考波长690 nm。
1.2.2 NGF对HSC-T6凋亡的影响 取对数生长期细胞,细胞悬液浓度调至5×105/ml,接种于 T-25培养瓶中,24 h后分别加入0 ng/ml及100 ng/ml的NGF培养24 h,收取所有细胞,取1×106洗涤细胞,加入100μl的结合缓冲液,再加入AnnexinⅤ-FITC染液和碘化丙啶(PI)染液各 2 μl,在室温下避光染色 30 min,然后再添加结合缓冲液300μl,以流式细胞仪检测HSC凋亡。
1.2.3 TGF-β1、Smad3、Smad7 表达的测定 取对数生长期细胞,细胞悬液浓度调配至7×104/ml,滴于预先处理好的置于6孔板内的盖玻片上,每孔0.4 ml,孵育24 h,将培养细胞在0 ng/ml及100 ng/ml的NGF中孵育,并另设不含NGF的空白对照组,继续培养24 h,然后以4%多聚甲醛固定细胞,分别使用 TGF-β1、Smad3、Smad7一抗,应用 SP法进行免疫细胞化学染色,DAB显色,苏木精复染,二甲苯透明,中性树脂封片,在光学显微镜下胞膜或胞浆呈棕黄色的为阳性细胞。每张切片在400×光镜视野下共取10个视野,计数各自阳性细胞所占比例。以各阳性细胞的百分数表示相应蛋白的阳性表达率。
1.3 统计学方法
采用SPSS 16.0统计学软件分析数据,计量资料用均数±标准差(±s)表示,采用 t检验,以 P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组细胞增殖情况的比较
实验组NGF与HSC-T6作用24 h后,其OD值为0.65±0.03,与对照组(0.73±0.01)比较,对 HSC-T6 的增殖具有显著抑制作用,差异有统计学意义(P<0.05)。
2.2 两组细胞凋亡情况的比较
实验组NGF作用HSC-T6 24 h后,凋亡率为(26.36±8.51)%,对照组为(6.88±1.35)%,两组比较,差异有统计学意义(P<0.05)(图1)。

 
图1 100 ng/ml NGF诱导HSC凋亡的流式细胞术观察
2.3 TGF-β1、Smad3、Smad7 蛋白表达的变化
实验组的TGF-β1、Smad3阳性表达细胞率分别为(25.26±2.04)%、(30.24±1.52)%,与对照组[(76.24±2.54)%、(59.65±1.25)%]比较,均明显降低(P<0.05),实验组的Smad7阳性表达细胞率为 (69.02±3.05)%,较对照组[(26.15±1.20)%]显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)(图2~5)。

 
图2 TGF-β1细胞免疫组化染色结果(S-P法,400×)

 
图3 Smad3细胞免疫组化染色结果(S-P法,400×)

 
图4 Smad7细胞免疫组化染色结果(S-P法,400×)

 
图5 空白对照组(S-P法,400×)
3 讨论
肝纤维化是肝硬化的早期病理改变和必经阶段,是由各种致病因素导致的肝脏慢性损伤。目前的研究结果认为,致病因素损伤肝细胞后,Kupffer细胞被激活,分泌出多种细胞因子,共同作用于HSC,最终导致细胞外基质在肝内过量积聚进而形成肝纤维化[3-5]。肝纤维化尚属于可逆性病理变化,但若不及时干预,可进展为肝硬化、原发性肝癌。HSC的活化和增殖是肝纤维化发生、发展进程中的一个关键环节。活化HSC已成为防治肝纤维化的主要靶细胞之一,抑制静止HSC活化、诱导活化HSC凋亡等是防治肝纤维化的一个重要策略[6-7]
肝纤维化是肝脏组织对各损伤作用进行过度修复的结果。而NGF作为一种重要的组织修复因子,其在肝纤维化的发生、发展中到底扮演着怎样的角色呢?有研究发现,在肝脏受损情况下,肝细胞可表达NGF,用重组体NGF培养HSC,细胞凋亡明显增多,且具有剂量依赖性,该作用可能通过调节NF-κB的活性而实现[8-10]。作者前期研究结果也显示,经 NGF作用的大鼠HSC出现明显的增殖受抑现象以及细胞凋亡形态学改变[11]。NGF可抑制 HSC合成Ⅰ、Ⅲ型胶原,诱导HSC凋亡,因此,抑制胶原分泌可能是NGF抗肝纤维化的作用机制[12]。另有研究表明,NGF可有效阻断由四氯化碳所诱导的小鼠肝纤维化,降低肝脏组织的炎症活动度[13]
机体内TGF-β异常表达可诱导各种肝病的发生,且在诱导HSC转化为肌成纤维样细胞的致纤维化进程方面,TGF-β的作用尤为显著[14-15]。在向肌成纤维样细胞转变过程中,大鼠HSC中TGF-β1 mRNA的表达水平显著高于 TGF-β2 mRNA和 TGF-β3 mRNA[16]。与 TGF-β2、TGF-β3比较,TGF-β1在肝纤维化进程中发挥了更重要的作用。TGF-β1对HSC等细胞的调控作用可通过自分泌和旁分泌的方式实现。TGF-β1在胞外被激活后,可通过特异性受体结合到活化的HSC等细胞胞膜上,继而主要由Smads介导,移位至细胞核,与具有特异序列的DNA相结合[17-18],调控ECM等因子的目的基因转录并发生高表达,如此推动肝纤维化的发生、发展。其中,Smad2/3作为TGF-β1在胞内主要的信号转导蛋白,负责信息的特异性转导;而Smad7则相反,主要是对该转导通路产生抑制作用[19-20]。TGF-β1/Smads通路在肝纤维化进程中的地位举足轻重,调控该通路以防治肝纤维化应为一种理想的选择。
目前,关于NGF如何诱导HSC凋亡机制的研究较少,而TGF-β1/Smads是促进肝纤维化进展的重要通路,NGF作为一种修复因子,是否通过此通路诱导HSC凋亡从而发挥抗肝纤维化的作用?本研究发现,NGF可抑制HSC增殖、促进其凋亡,其机制可能为通过上调 Smad7表达、抑制 Smad3表达,最终降低TGF-β1表达水平,为今后进一步研究NGF作用于HSC的相关作用机制提供前期实验基础,为防治肝硬化及肝纤维化提供新路径。
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(收稿日期:2018-01-31 本文编辑:许俊琴)